细胞培养中细菌类微生物污染的快速检测

［摘 要］ 目的  检测细胞培养中细菌类（包括支原体）微生物的污染情况。 方法  用细胞培养中常见的培养物人为污染He-La细胞，设计细菌类微生物16S rRNA基因序列通用引物，PCR扩增16S rRNA基因序列片断，建立PCR检测培养细胞污染的方法，并用该方法检测本室保存的细胞株的污染情况。结果  人为污染绿脓杆菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌和支原体M.fermentans的Hela细胞的培养上清中均扩增出大小的片段，与目的片段相符。本室所收藏的15个细胞株有3株的培养上清中扩增出大小的片段。 结论  本实验建立了16S rRNA基因序列通用引物PCR法，可用于快速检测培养细胞中细菌类微生物的污染。      

　　［关键词］ 细胞培养;细菌;污染;PCR      

　　Rapid detection of bacterial or microbial contamination in cell cultures

           

　　Abstract:Objective To investigate a fast and simple method to detect bacterial contaminations including Mycoplasma contamination in cell cultures.Methods HeLa cells were used for propagation P.aeruginosa，E.coli，S.epidermidis and M.fermentans，respectively.The suit-ability of PCR based on the universal primers for the16S rRNA gene sequences of prokaryotic cells for the detection of bacterial contamination in He-La cell cultures was investigated.Then this method was used to test15cell strains in our laboratory.Results Nearly1500bp region was amplified from all of the HeLa cell cultures contaminated by P.aeruginosa，E.coli，S.epidermidis or M.fermentans.Of the15cell strains in our labora-tory，3were tested positive using this method.Conclusion The PCR method based on the universal primers for the16S rRNA region of prokaryotic cells might be used for the rapid detection of bacteria in cell cultures.

     

　　Keywords:cell culture;bacteria;contamination;PCR

      

　　细胞培养被微生物污染，是常见而又严重影响细胞培养后续研究工作的问题。微生物污染包括真菌类，细菌类（包括支原体）以及病毒类对培养物的污染。其中真菌污染后不难被发现，而病毒污染的检测应根据不同的病毒选用不同的方法，而且需要建立相应的参照系统，属于病毒学范畴，在普通实验室不易推广。细菌类微生物，特别是某些细菌和支原体污染后，对培养液无肉眼可见影响，是细胞培养中最常见，不易被察觉又干扰实验结果的问题［1-5］ 。因此，检测并消除细菌类微生物污染在细胞培养工作中至关重要。PCR技术用于检测培养物中支原体污染的研究已有报道［1-4］ ，但由于培养物的DNA提取以及PCR技术本身要求的实验条件及成本较高，在普通实验室不易推广;设计的引物如果不能涵盖所有的支原体种也容易造成检测标本的假阴性［3］。本实验采用煮沸法粗提DNA，合成细菌类16S rRNA特异性序列通用引物，用PCR扩增法对培养物进行检测，真正做到廉价、灵敏、简便和快速。而且早期即可以检测到细胞培养中细菌类微生物的污染，对于污染后的挽救也有重要意义。

    

　　1 材料与方法

　　1.1 细菌参考株      

　　绿脓杆菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌，由本室保存;支原体M.fermentans等，由北京军事医学科学院温博海教授惠赠。

　　1.2 细胞株    

　　无支原体污染的HeLa细胞，由保井孝太郎教授惠赠。作为阴性对照和实验室人为污染的细胞样品。本室所收藏的细胞系共15个细胞株。    

　　1.3 实验室人为污染HeLa细胞    

　　分别刮取各种常见细菌冰晶，接种于LB培养基，支原体接种于牛心浸液，37℃过夜培养。取50μl上述培养物接种于新传代的HeLa细胞，共同培养。    

　　1.4 细菌基因组DNA的煮沸法小量制备    

　　取各个感染组的培养上清，12000r.min离心30s，弃上清后加入200μl PBS重悬，将重悬液于沸水（100℃）中煮5min，12000r.min离心15min，吸出上清移入一个新的EP管中，加入冰预冷的异丙醇200μl，于-20℃放置15min。12000r.min离心5min，弃上清，用50μl TE缓冲液重悬。

　　1.5 PCR扩增    

　　PCR扩增细菌类16S rRNA特异性序列通用引物［6-7］ 。上游引物（A-17）:5′-GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′;下游引物（3-17）:5′-AAG GAG GTA ATC CAG CC-3′;扩增片段大小约1500bp。

2 结果    

　　2.1 检测细胞培养中细菌类微生物污染的通用性    

　　本实验所用的引物是根据温博海等［7］设计的原核细胞16S rRNA基因序列通用引物。人为污染绿脓杆菌、大肠杆菌、白色葡萄球菌，以及支原体M.fermentans的Hela细胞的培养上清中均扩增出约1500bp大小的片段，与目的片段相符（图1）。    

　　    

　　图1 PCR方法的通用性检测结果（略）

    

　　2.2 灵敏度检测      

　　根据紫外分光光度计A值计算，煮沸法小量制备的细菌基因组DNA的浓度为13μg.ml，10倍系列稀释后，分别取1μl作为模板进行PCR扩增。当模板浓度降低到52fg.ml时，在1500bp处仍可见明显的扩增条带（图2）。    

　　　图2 PCR方法的灵敏度检测结果（略）

    

　　2.3 初步应用      

　　用上述方法检测了本室所冻存的11个细胞系中冻存批次较早细胞（表1），其中有3个批次的培养上清中扩增出1500bp大小的片段，认为该批次的冻存细胞污染了细菌类微生物，考虑到这些细胞系较廉价，故将该批次以及来自该批次来源的其他冻存细胞丢弃。

     　　表1 本实验检测的体外培养细胞株（略）

   

　　3 讨论      

　　细胞培养被细菌类微生物（包括细菌和支原体）污染，是常见而又严重影响细胞培养后续研究工作的问题。特别是支原体污染，对体外培养的细胞的几乎所有的指标及产物均有影响，而且可以不被察觉地随着细胞的传代而传代［1-5］ 。早在1994年Wirth等［1］ 就利用PCR技术检测培养物中支原体的污染，但由于培养物的DNA提取以及PCR技术本身要求的实验条件和成本较高，在普通实验室不易推广;而且设计的引物如果不能涵盖所有的支原体种也容易造成检测标本的假阴性［3］。所以多数实验室宁可将怀疑有污染的细胞丢弃，也不进行检测。本实验采用煮沸法粗提DNA，合成原核微生物16S rRNA特异性序列通用引物，用PCR扩增法检测细胞培养物中是否有原核微生物的存在，建立了简便廉价且灵敏快速的细胞培养中细菌类微生物污染的检测方法。   

　　本实验采用煮沸法粗提细菌基因组DNA，成本低且简便易于操作，当模板量降低到52fg.ml时用PCR法仍可扩增出目的条带，说明该方法比较灵敏快速，可以在污染的较早期迅速检测到污染的存在，对一些珍贵细胞的挽救非常重要。另外，16S rRNA基因序列是原核生物特有的基因序列而且比较保守，在细菌的分类中被认为是分子进化钟［6-7］ ，本实验利用通用引物扩增这一区段，还可以进一步测序证实污染物的种类，以便进行有针对性的挽救。

    作者：万颖杰，张俊磊，安静《局解手术学杂志》

　　［参考文献］     

　　［1］WirthM，Berthold E，GrashoffM，et al.Detection of mycoplasma contaminations by the polymerase chain reaction［J］.Cytotechnol-ogy，1994，16（2）:67-77.

   

　　［2］王正森，吴建新，赵小元，等.用PCR检测细胞培养中支原体污染［J］.生物化学与生物物理进展，1994，21（6）:553-556.

   

　　［3］Uphoff CC，Drexler HG.Detection of mycoplasma contaminations in cell cultures by PCR analysis［J］.Hum Cell，1999，12（4）:229-236.   

　　［4］Uphoff CC，Drexler HG.Detecting mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction［J］.Methods Mol Med，2004，88:319-326.    

　　［5］ Wang H，Kong F，Jelfs P，et al.Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization［J］.Appl En-viron Microbiol，2004，70（3）:1483-1486.   

　　［6］Perez M，Rikihisa Y，Wen B.Ehrlichia canis-like agent isolated from a man in Venezuela:antigenic and genetic characterization［J］.J Clin Microbiol，1996，34（9）:2133-2139.   

［7］温博海.立克次体16S rRNA基因序列分析［J］.中国人兽共患病杂志，1999，15（6）:18-20.