细菌鞭毛染色法染色条件的探讨

［摘要］  目的  探讨不同的染色条件对细菌鞭毛染色效果影响，寻找一套适合的染色方法。方法  将37 ℃培养18～24 h的普通变形杆菌培养物，稀释成菌悬液制片、染色，比较不同的菌悬液浓度、处理时间、染色时间和染色方法对细菌鞭毛染色效果的影响。结果  浓度为1.5×1012/L的菌悬液37 ℃放置10 min制片，用石炭酸复红法染色10～15 min，水洗，干燥镜检，其背景清晰，80%～90%的细菌有鞭毛，菌体红色，鞭毛淡红色，染色效果理想。结论  细菌鞭毛染色过程中菌悬液的浓度、菌悬液的处理时间、制片方法以及染色时间的长短等条件影响鞭毛染色效果。

    ［关键词］  普通变形杆菌；鞭毛；染色与标记

    A STUDY OF STAINING CONDITIONS FOR BACTERIAL FLAGELLUML RUI

    (Department of Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

    ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the staining of bacterial flagellum under different staining conditions and to find an appropriate way of it.MethodsThe Proteus vulgaris culture was cultured at 37 ℃ for 18-24 h, then a slide was made by the diluted suspension and stained. The staining result of bacterial flagellum under different conditions, such as the concentration and handling time of the suspension, staining time and staining methods, was compared. ResultsA slide of bacterial suspension with a concentration of 1.5×1012/L , to be placed at 37 ℃ for 10 min then stained by carbolfuchsin for 10-15 min. Under a microscope, a clear background with red thalli and faint red flagellum could be seen in 80%-90% of the bacteria.ConclusionThe concentration and handing time of suspension, slidemaking method and staining time are important factors for an ideal flagellum staining.

    ［KEY WORDS］Proteus vulgaris; flagella; staining and labeling

    细菌鞭毛染色是医学微生物学实验和临床细菌学诊断中一项常用的实验技术，通过鞭毛染色，可以观察鞭毛的形态、数量和鞭毛在菌体分布的位置，并以此来鉴定细菌的一些重要特征［1］。然而，在细菌鞭毛染色的实际操作中往往较难取得预期的效果。经过多年的染色实践，作者认为，染色的成功与否在很大程度上取决于对染色条件的掌握。本文就细菌鞭毛染色过程中出现的一些问题及现象进行了探讨。现报告如下。

    1  材料和方法

    1.1  实验材料

    菌种为普通变形杆菌，由我院微生物学教研室保存；普通培养基，购自北京陆桥生物制品有限公司；石炭酸复红鞭毛染色液［2,3］，由饱和钾明矾液2 mL、50 g/L石炭酸5 mL和200 g/L的鞣酸液2 mL混合而成，临用时加1 mL碱性复红乙醇饱和液；石炭酸结晶紫鞭毛染色液［3］，为饱和钾明矾液5 mL、50 g/L石炭酸5 mL和鞣酸1 g混合而成，临用时加1 mL结晶紫乙醇饱和液；干净载玻片。

    1.2  实验方法

    1.2.1  石炭酸复红鞭毛染色法  ①菌悬液的制备［4~6］：将普通变形杆菌接种在营养琼脂中，37 ℃培养18～24 h，挑取培养基中迁徙生长边缘的菌苔少许，加入盛有适量无菌蒸馏水的试管中，制成4种不同浓度的菌悬液（比浊法），分别为1.5×1012/L、3.0×1012/L、6.0×1012/L、9.0×1012/L。②菌悬液的处理：菌悬液置37 ℃温箱孵育5、10、15、20 min。③载玻片的处理［7］：将载玻片用肥皂粉洗净，自来水反复冲洗，蒸馏水冲洗3次，晾干，置于无水乙醇中，过夜，备用。④制片方法：载玻片从无水乙醇中取出，直立于吸水纸上，吸去多余的乙醇，然后将载玻片在乙醇灯火焰上经过2～3次即可使用（注意不可用手触摸载玻片表面）。按照文献［7］的方法用菌悬液制片，37 ℃干燥。⑤染色：制片干燥后滴加鞭毛染色液数滴覆盖有菌处，作用5、10、15 min，水洗，干后镜检。

    1.2.2  石炭酸结晶紫鞭毛染色法  染色步骤同石炭酸复红鞭毛染色法。制片干燥后滴加石炭酸结晶1期吕锐细菌鞭毛染色法染色条件的探讨81紫鞭毛染色液数滴，作用5、10、15 min，水洗，干后镜检。

    2  结    果

    2.1  菌悬液浓度对细菌鞭毛染色的影响4种浓度的菌悬液中，以1.5×1012/L的菌悬液染色效果最好，菌量合适，菌体、鞭毛均清晰可见。3.0×1012/L、6.0×1012/L的菌悬液染色效果次之，菌量稍多，有些细菌鞭毛交叉重叠、发生粘连。9.0×1012/L菌悬液染色效果最差，菌量太多，有些菌体不能着色，不利于观察。

    2.2  放置时间对细菌鞭毛染色的影响放置10 min的菌悬液制片染色效果最好，菌体、鞭毛粗细合适，清晰可见；放置5 min的菌悬液由于时间太短，鞭毛细小，染色浅，不易观察；放置15、20 min的菌悬液由于时间太长，菌体、鞭毛均膨胀过大，而且很多鞭毛脱落，制片的效果不好。

    2.3  染色时间对细菌鞭毛染色的影响染色10、15 min的效果好，菌体、鞭毛着色深且清晰；染色5 min的菌体、鞭毛着色浅，不易观察。

    2.4  与石炭酸结晶紫鞭毛染色法的比较

    复红法染色80%～90%的细菌有鞭毛，菌体红色，鞭毛淡红色，背景清晰；结晶紫法60%～70%的细菌有鞭毛，菌体和鞭毛均呈淡紫色，背景模糊，鞭毛和染料颗粒有粘连，观察效果不好。

    3  讨    论

    鞭毛是某些细菌的一种特殊结构。因鞭毛纤细，直接在光学显微镜下观察不到，必须经过特殊的鞭毛染色，增粗鞭毛直径后再着色，才能在光学显微镜下看到。鞭毛染色是微生物学实验中一项常用、不易把握、又难以达到预期效果的染色技术，由于影响染色效果的因素较多，又没有一些量化的指标，所以很多时候都不能取得满意的效果。本文对鞭毛染色的一些条件进行了探索，结果显示，合适的菌悬液浓度、菌悬液的正确处理方法、制片的技术、染色时间以及不同的染色方法对鞭毛染色的成功具有非常重要的意义。菌悬液浓度过高，会使菌量过大，鞭毛交叉粘连，不利于观察。菌悬液37 ℃处理时间过长，菌体、鞭毛膨胀过大，鞭毛脱落；处理时间过短，鞭毛纤细，不易着色。另外，载玻片要严格处理，不能含油脂，不可用手触摸载玻片的表面，不能用取菌环涂片，否则会使鞭毛脱落。在染色时间的把握上，时间过短鞭毛不着色，而时间过长鞭毛染料颗粒发生粘连。同时，本文还对两种染色方法进行了比较，结果表明，复红法染色后背景清晰，染料颗粒少或没有，容易观察，鞭毛染出百分率高；结晶紫法染色后则染料颗粒多，背景模糊，鞭毛染出百分率低。本文结果显示，培养18～24 h的普通变形杆菌，制成浓度为1.5×1012/L的菌悬液，经37 ℃处理10 min，按照文献［7］的制片方法制片，采用石炭酸复红鞭毛染色法作用10～15 min，可取得满意的染色效果，重复性也好。该方法简单、快速，染液配制不复杂，除了可用于实验教学外，在一些细菌学的诊断中也具有一定的意义。我们用同样的染色条件对大肠杆菌、伤寒杆菌、铜绿假单胞杆菌、副溶血弧菌进行鞭毛染色，均取得令人满意的结果。值得注意的是，不同菌种鞭毛的形成与温箱中培养的时间有着密切的关系，这在文献中已有报道［1,8］，也是在鞭毛染色中应该注意的。另外，还有其他一些染色方法如Bailey法、银染色法、户田法等［5,6,9］，都需要进行改良才能取得比较满意的效果，准备工作比较繁琐，不如本文的染色方法简单、快速、容易掌握。因此，教学工作中采用石炭酸复红法进行鞭毛染色，不仅节省时间，提高工作效率，而且染色效果好，值得推广使用。

 

作者：吕锐   《青岛大学医学院院报》 （青岛大学医学院微生物学教研室，山东 青岛  266021）

    ［参考文献］

    ［1］古海瀛.细菌鞭毛染色意义［J］.海南医学，2003，14（3）：12.

    ［2］倪星语，王立霞，李文汉，等.微生物学和微生物学检验实验指导［M］.北京：人民卫生出版社，2001：8.

    ［3］刘昌平，陈恩华.三种细菌鞭毛染色法比较［J］.中国微生态学杂志，1995，7（1）：62.

    ［4］骞锐，李芹阶，刘启富，等.鞭毛染色法染色条件的探索［J］.第三军医大学学报，1998，20（2）：183.

    ［5］曹杰，张敬学，屠静，等.改良细菌鞭毛染色法及验证试验结果［J］.北京医科大学学报，1997，29（5）：474.

    ［6］刘德容.细菌鞭毛染色方法的再改进［J］.微生物学通报，1998，25（2）：119.

    ［7］李宏.细菌鞭毛染色中几种制片方法比较［J］.生物学通报,1999,34(12):33.

    ［8］戴献英.细菌产生鞭毛与培养温度和时间的关系［J］.云南农业大学学报,1989,4(1)：84.

    ［9］李新华，邓文.改进鞭毛染色法［J］.泰山医学院学报,1995,16(3):281.