建立一种粪便细菌学检验的新方法---肠道菌谱分析

[摘要］目的 建立一种以粪便标本细菌菌谱分析为主要内容的细菌学检验方法。方法 取粪便标本直接涂片做革兰染色，镜检观察标本中细菌数量、种类及比例，并进行显微照相；对粪便标本进行菌群培养，分离病原菌，并与镜检结果进行对照；将照片进行分类，建立菌群失调和病原菌感染的图谱。同时以正常大便菌谱作对照。结果 因菌群失调导致的腹泻，直接镜检表现为细菌数量和种类普遍减少，或某一类细菌增多或减少，或呈单一种类细菌；由某种病原菌引起的腹泻，直接涂片多数只能见到革兰阴性杆菌，且细菌数量少或极少，一般均与培养结果相符。结论 粪便细菌菌谱分析能直接或间接为临床提供腹泻患者的肠道微生态资料，尤其能准确地提示因各种原因造成菌群失调而导致的腹泻，为临床诊断和制定治疗方案提供快捷、科学的依据。

 

 

    长期以来，粪便标本细菌学检验主要是以分离沙门菌属和志贺菌属细菌为目的。但随着新的腹泻病原菌的不断被发现以及各种因素造成菌群失调引起的腹泻不断增多，传统的粪便细菌学检验方法和内容已不能满足现代医学诊治的要求。我们通过建立粪便涂片细菌菌谱，对粪便标本进行病原菌分离培养，及对肠道菌菌谱的分析，为临床提供真实可*的病因病原学诊断依据。

 

1 材料与方法

 

1.1材料

1.1.1标本来源  粪便标本568 份，均取自2003 年5-12 月来我院就诊的腹泻患者。其中门诊患者54 份，住院患者484 份；男性356 份，女性212 份；< 14 岁的儿童369 人份，> 60 岁的老年人74 人份。对照粪便（性状：软、成形）60 份，即每做10 份标本加l 个对照。

1.1.2 培养基  5 ％羊血平皿（BA）、SS 平皿、l % 山梨醇麦康凯平皿（Mac ) ，均按标准自制。培养基干粉、药敏纸片、诊断药敏纸片等购自法国梅里埃生物有限公司；生化鉴定管购自杭州天和微生物生物试剂有限公司。

1.1.3 诊断血清  霍乱弧菌、肠致病性大肠埃希菌( EPEC）、沙门菌属和志贺菌属诊断血清，均购自卫生部兰州生物制品研究所。

1.1.4 显微镜（OLYMPUS)   BX41 显微镜及JVCTK-C1381EG 彩色摄像仪，购自朗咖生物医学工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 涂片染色  568 份腹泻粪便标本和60 份正常对照粪便标本均直接涂片，革兰染色，置油镜下镜检，详细记录各类细菌形态、大致数量及比例，并进行显微照相，标码后存于电脑中。对照组直接涂片镜检，油镜下印象：各类细菌均有分布，数量约500-5000个/油镜视野（婴幼儿粪便细菌量较成人少）。革兰阳性（G +）杆菌、革兰阴性（G-）杆菌、G+球菌、G-球菌等4种菌的比例约为60:35:4:1，优势菌为G +杆菌。

1.2.2 菌群培养  取每份粪便标本分别接种营养平皿做4 区划线（评估菌量），置36 ℃ 温箱24,48,72h 后观察细菌（需氧菌）在营养平皿4 区上的生长情况。用打加号的方法记录细菌的生长量，即4个划线区都有菌（每一区菌落数≥10 个，下同）打4 + ; l,2,3 划线区有菌打3 +; l、2 区有菌打2+; 1 区有菌打l +。同时观察细菌在此培养基上的形态特征及各菌种间的比例，必要时挑取可疑菌落做革兰染色，以便对菌谱分析结果作出初步判断。对照组菌群培养：4 个划线区菌量丰富可打4＋。平皿上菌落较纯，为G-杆菌（未作厌氧培养）。

1.2.3 分离培养  各取一环标本分别接种BA , SS , Mac3 种培养基，36 ℃ 培养24 , 48 , 72h ，记录细菌在各种培养基上的生长情况，挑取可疑菌落（无色透明不发酵乳糖或迟缓发酵乳糖菌落）进行菌种鉴定。对照组分离培养：上述培养基上均未见到可疑菌落。

1.2.4 血清学鉴定  对疑似致病性大肠埃希菌菌落用EPEC 抗血清做凝集试验；对疑似霍乱弧菌、沙门菌、志贺菌菌落分别用相应的抗血清做凝集试验。

1.2.5 药敏试验  对检出的致泻菌按照美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）的要求，采用K-B 法做药敏试验。

 

2 结果

 

2.1  粪便标本革兰染色镜检  其菌群象大致分为以下几种类型。（l）成形、软的正常粪便菌群象：一般是细菌量丰富，G+菌与G-菌比例恰当，细菌的形态呈现多样性，优势菌为G+杆菌。（2）粘液样脓血便菌群象：多数只见到G-杆菌，细菌量少或极少。（3）稀糊样便菌群象：正常与异常菌群象并存（因为婴幼儿粪便多以稀糊样便为主），以G+球菌为主者，成双、成链或成堆排列；有部分菌群象中可见到多量或少量真菌抱子及菌丝；以G-杆菌为主者细菌常呈多形性，而培养细菌种类比较单一。（4) 水样稀便菌群象：有相当一部分菌量稀少，或者单独以G+球菌或G-杆菌或真菌为优势菌，有些标本甚至观察不到细菌。各类菌群象见彩图1-9 （插页）, 涂片染色镜检片印象见表l 。

2.2  菌群培养  分别于24 , 48 , 72h 观察4 区划线的营养平皿。成形软便标本经过培养，4 区菌落都很丰富，可打4 +（且基本以为G-杆菌为主）。脓血便标本经培养后，平皿上菌落数较前一种标本要少很多，多数只有1,2 区有菌,而3 ,4 区无菌或菌落极少，可见到1-3 种菌落，多为G-杆菌；有可疑菌落，需进行分离鉴定。稀糊样便经培养后，菌落数有部分丰富，部分稀少，前者可以打4 +，后者则打1～2 + ；这种性状的标本多数可培养出1种以上的细菌，有部分以G-杆菌为优势菌，有部分以G+球菌为优势菌，有部分可同时见到G+球菌和杆菌（服整肠生后，粪便中可见到G+杆菌）及真菌3 种或3 种以上菌落，还有部分则以真菌为优势菌。水样稀便经培养后，多数菌落稀少，可单独以G-杆菌或G+球菌或真菌或G+杆菌为优势菌，也可几种菌同时出现，另有一些标本，在上述几种培养基上经72h 培养后仍无细菌生长。

2.3  分离培养  在进行上述2 项试验的同时，做分离培养。成形软便经培养，在选择和非选择培养基上，一般找不到致泻菌落。脓血便培养，在选择培养基上可见到2 种或2 种以上菌落，多数可找到致泻菌。稀糊和水样稀便经培养，如G-杆菌为优势菌，则BA和选择培养基上都可有多量或少量菌生长，同时可找到致泻菌菌落；如以G+菌为优势菌，则BA上可见到多量或少量G+菌菌落，真菌菌落；选择培养基上无细菌生长（真菌和肠球菌可在选择培养基上生长）。将分离出的疑似致泻菌进行系列生化鉴定及血清学鉴定, 568份标本分离出致泻菌15种302株，见表2 。

2.4 菌谱分析  （l）成形软便菌群象：细菌量丰富，分布均匀，两种染色性状细菌及各种类型的细菌比例基本恰当，未分离出可疑菌落（致泻菌）的标本可向临床发出“未检出致病菌”( BA，SS，Mac）的报告。(2）粪便为粘液脓血便，其菌群象为单一的G-杆菌，细菌量少甚至极少，培养基上能见到可疑病原菌菌落，经生化系列鉴定、血清学鉴定，并做药敏试验，向临床发出鉴定及药敏报告。（3）粪便为稀糊样或水样，其菌群象则为G+球菌、杆菌及G-杆菌、真菌孢子、菌丝，菌量或多或少，呈纯菌或无菌；培养有多量或少量G+球菌菌落、酵母样真菌菌落，或为某种菌的纯培养，或各培养基上无菌生长（24h , 48h , 72 h 培养），对上述菌落可做鉴定，并根据菌群象、菌群培养、分离培养粗略估计某种菌的百分比，向临床发出“XXX 菌％”、“无细菌生长”( BA，SS，MaC，营养平皿），提示“菌群失调”报告，不报告分离菌的药敏结果。各科室菌谱分析统计结果见表3 。

2.5 粪便涂片与分离培养结果  对照302份阳性标本粪便涂片与分离培养结果相符，67 份不相符。见表4 。

3 讨论

 

    在人类肠道中存在着大量的微生物（如细菌、原虫、病毒等），其中主要是细菌，约占粪便固体总量的20％-30 % ，正常人粪便中的菌群分为常居菌和过路菌两大类，在这些菌中99％以上是厌氧菌（多数为G+杆菌），需氧菌不到1％。乳婴粪便中多为G+菌（为嗜酸性乳杆菌、双歧杆菌类及粪链球菌）, 而成人粪便中除占优势的厌氧菌外多为埃希菌类，所有这些细菌组成人类肠道正常菌群。肠道正常菌群在一般情况下，数量及各菌种间的比例都处于一种相对的动态平衡中。对机体的营养、消化、吸收、防御疾病，保持人体与外界环境的平衡起着重要的作用。一旦由于某种原因破坏了正常菌群内各种微生物之间的相互制约的关系，使菌群的量和种类的比例发生变化时，肠道微生态环境被破坏，即出现暂时或持久的菌群失调，肠道功能发生紊乱，甚至出现明显的临床症状---腹泻。

    对于腹泻，临床上习惯用病理学的观点寻找病因，而忽视用生理学的观点与方法去研究。本文试图用病理学与生理学相结合的方法对腹泻患者进行病原微生物的检测及肠道菌群的监测，对粪便进行菌谱分析。一方面找出病原菌，对腹泻进行病原学诊断并做药敏试验；另一方面，通过对肠道菌群象的观察和菌群培养，确定菌群失调，找出致泻病因，为临床正确应用抗生素治疗，或者停用抗生素进行菌群调整提供科学的依据。

    通过对568份粪便标本进行菌谱分析，检出（超量）酵母样真菌98 株，占分离菌总数的32.45 % ，列第1位；菌谱分析为“某种肠球菌50 ％以上”或“无细菌生长”，提示“菌群失调”标本88 份，列第2 位。检出导致腹泻的条件致病菌、过路菌（在涂片观察及菌群和分离培养基上均为明显的优势菌，细菌比率在30％以上）88 株（如克雷伯菌属、铜绿假单胞菌、变形杆菌属等）；检出EPEC和志贺菌属、沙门菌属等特异性病原菌75 株。上述实验资料可以说明现代细菌性腹泻病的主要病因在很大程度上是由菌群失调所致。因此，粪便细菌菌谱分析将成为对腹泻病进行病原学诊断和对肠道菌群进行监测的重要手段。在表l中，有31份粪便徐片镜检未见细菌或真菌，菌群及分离培养72h 无细菌生长。从表3可以看出，菌谱分析结果以G+球菌或酵母样真菌为优势菌，或“无细菌生长”，提示菌群失调，患者往往是住院患者、老年患者、婴幼儿。这类患者免疫力低下，多数长期患病，或因外科手术，大量使用广谱抗菌药物、免疫抑制剂、激素、抗肿瘤药等，使肠道正常菌群受到严重抑制，以致出现粪便标本涂片镜检细菌稀少、无菌或培养时无菌生长等现象；或者引发肠球菌、真菌或其他一些耐药菌株过度繁殖，导致肠道菌群严重失调而出现明显的临床症状---腹泻。表4 显示，粪便菌群象观察的阳性率比培养阳性率高11.80 % ，这是因为直接涂片呈现的是肠道原始的微生态环境，许多微生物我们无法辩认或很难培养。

    以上实验结果说明，肠道菌谱分析不但能为临床腹泻病提供病原学诊断依据及药敏报告，更能对肠道菌群进行监测，也可作为抗菌药物使用的监测窗口。本方法包括涂片、培养、药敏试验3 项主要内容。结果采取分级报告制：2h 报告涂片结果；24h 报告培养结果；最后（48 或72h ）对各项结果进行综合分析，报告鉴定和药敏结果。平均出结果时间为36.5h ，比传统培养及药敏出结果的60h 大为缩短，并扩大对腹泻的细菌学实验诊断范围。但由于腹泻病因的多样性、复杂性，肠道菌谱分析的研究有待进一步深人与完善。

作者：盛茂地  黄金娥  卿秀平 黄宏兰  张俭《中国感染控制杂志》