细菌鞭毛染色的方法

目前，细菌鞭毛染色方法根据染色剂的不同，可分为碱性复红法、副品红法、结晶紫法、维多利亚蓝B法、镀银染色法和荧光蛋白染色法6类，前5类方法的媒染剂成分中均含有单宁酸，染色原理通常是采用不稳定的胶体溶液做媒染剂，并使其沉淀于鞭毛上而使“鞭毛肿胀（tar and feather）”，鞭毛直径加粗，进一步染色后即可在油镜下观察。
1. 碱性复红法和副品红法：1926年由Gray首创，其媒染液成分包括20%丹宁酸水溶液2.0ml，硫酸钾铝饱和水溶液5ml，饱和氯化汞水溶液2ml，3%碱性复红乙醇（95%）溶液0.4ml，临用前混合，且需过滤后方可使用。染片时，媒染剂染色约6min，具体时间尚需在试验中摸索确定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸复红染液，染片时需要1小片吸水纸盖在涂片上，染色3min。由于该方法媒染剂混合物不稳定、操作复杂、经验性强。Leifson于1930年建立了副品红法，并于1938年和1951年两次对该方法进行了改良，称为Leifson方法。染色试剂由3种溶液组成：A为1.5%NaCl水溶液，B为3%单宁酸水溶液，C为乙酸副品红0.9g，碱性副品红0.3g溶解于100ml95%乙醇溶液中。使用时把等体积A和B混合，然后再加2体积C与之相混。该试剂冷藏可保存1～2个月。

2. 结晶紫法：又称Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等进行了改良。媒染剂：5%石碳酸10 ml，2g单宁酸和10 ml饱和硫酸钾铝。染色剂：饱和结晶紫乙醇溶液，即12g结晶紫溶于100 ml无水乙醇中。使用时把10份媒染剂与1份染色剂混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色试剂，采用湿片技术进行鞭毛染色，虽然可以观察到细菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法优点是试剂比较稳定，目前Difco公司已经研制出该方法的商品试剂盒，但染色效果亦不甚理想.
3. 维多利亚蓝B法：1990年由Inoue等报道日本制药株式会社Shionogi Seiyaku研制出一种细菌鞭毛染色商品试剂盒。其试剂组成包括维多利亚蓝B、苯酚、单宁酸和硫酸钾铝，染色约需7min。该试剂保存期约为6个月，关于其染色效果虽然有过一篇文献评述，但却没有采用评分法进行评价，很难判断其染色效果。
4. 镀银染色法：1958年Rhodes根据Fontana的螺旋体改良镀银染色法，建立了一种细菌鞭毛镀银染色法。试剂分为媒染剂和银染剂。媒染液：10%单宁酸10 ml加5 ml饱和硫酸钾铝水溶液，再加1 ml苯胺饱和水溶液形成沉淀，通过摇动又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，稳定10 min后使用。银染液：配制5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml备用，再缓慢加入浓氨水（比重0.880）使形成的沉淀刚好重新溶解，最后把备用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到摇动后呈现轻微而稳定的薄雾状溶液为止，避光保存，可稳定数周。用媒染液染片3～5min，蒸馏水充分洗涤后，再把银染液滴加至涂片上。加热至接近沸腾，染色3～5min。由于Rhodes镀银染色法媒染液成分复杂、操作繁锁，所以1965年Blenden等改良了细菌鞭毛镀银染色法的配方。试剂A：100 ml蒸馏水中加入5 g单宁酸，1.5 gFeCl3，15%福尔马林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。试剂B：使用2% AgNo3，其他同于Rhodes，但试剂不稳定，要求在4h内使用，并用要用氨水调pH至10。试剂A染片2～4min，试剂B染色30 s，不需加热。由于以上两种镀银染色方法都要使用营养琼脂斜面培养物，并且需用无菌蒸馏水悬浮菌液制片，未采用评分法评价镀银染色方法。因此1977年，West等对镀银染色法进一步改良，制备涂片时直接使用血平板，评价染色效果首次使用5分制，通过该评价方法证明了加热银染液染片可以提高染色效果。试剂配方：媒染液为饱和硫酸钾铝水溶液25 ml，10%单宁酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配制同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，银染液滴加至涂片上加热至微冒蒸汽，染色4min。同时West等还对使用不同培养基进行染色效果评价，包括半固体动力培养基、血琼脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜面，其中半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h；血琼脂平板35～37℃，培养18～24h。评价结果血琼脂平板35～37℃，培养18～24h不适于细菌鞭毛染色，而半固体动力培养基和TSA斜面25℃，培养18～24h适合于细菌鞭毛染色，同时也证明了使用福尔马林处理标本制备涂片并不能有效阻止鞭毛脱落。由于镀银染色法媒染液不稳定，需避光5℃保存，1992年Porter等继续改良该方法，其试剂配方同West等的方法，只是媒染剂避光室温可保存数月，延长媒染剂染色时间为8 min，染色液不需加热，只染30 s，制备涂片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培养24h，但遗憾的是Porter等只使用了1种细菌（奇异变形杆菌）进行研究。于是1994年Finegan等进一步证实使用过期媒染剂进行镀银染色可以增强鞭毛染色效果，并使用4种细菌（绿脓假单胞、奇异变形杆菌、黏质沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用trypitcase soy肉汤及其琼脂平板，26℃培养24h。试剂配方仍不变，媒染液放置1、2、4、8、16周后进行染色，媒染液染色8 min，银染液染色30～60 s，不需加热。这4种细菌均染色成功，从而证明媒染液可至少放置16周。
5、鞭毛的负染：具体操作：菌悬液，直接滴在铜网上，1－2分钟后，吸去多余的菌液（似干非干的程度），再滴上0.1％的磷钨酸溶液，1分钟后，吸去多余的染液，然后就可以在电镜下观察了。一般染色后十五天之内看电镜。时间太长效果不好。这是我试验用的方法。
6、我喜欢用银染法，曾做过一段时间的细菌鉴定，以下是我一些染色心得：首先染色用玻片一定要干净，洗液泡过之后蒸馏水冲洗干净。涂片的时候菌千万别涂得太多。第一部染色时，可将玻片置于水浴锅内，温度保持在35度,盖上盖（主要是保持一定的湿度，防止染色液变干不利于冲洗，这步非常有用)。一定要将第一步使用的媒染液冲洗干净，否则影响染色效果，背景可能非常 脏。其他的步骤参考书上的资料进行，一般没什么问题。我用这种方法染单鞭毛的弧菌，效果非常好。

注意事项：
1. 要注意培养条件和培养时间：①用点接法在新配制的牛肉膏蛋白胨半固体平板上接种。一般一个平板点接3～4处。经比较用半固体培养基培养出来的菌体活动度大，鞭毛长且多，易于染色，这可能与半固体培养基更适于菌体运动、鞭毛生长较好有关。用点接种法在平板上接种更易于挑取边缘幼龄的菌体。②培养时间要严格掌握，一般培养9～12h较好，菌龄超过15h，鞭毛染色效果较差，这可能与老龄菌体活动度降低、鞭毛易脱落有关。

2.染色过程中的细节也应充分注意：①取菌要取菌落边缘的幼龄菌体。②取菌后的接种环在载片上的蒸馏水中轻轻沾几下即可，不要用力太猛，更不能用接种环大幅度涂开；将载片稍倾斜，使菌液散开即可，否则鞭毛易脱落，造成染色失败。③鞭毛染色的玻片只能自然干燥，不能用热风吹干，不能热固定，这是由于加热后菌体易变形，鞭毛易脱落，影响观察。④A染液染3～5 min，其后用蒸馏水（自来水效果差）冲洗时一定要充分，否则加B染液后，背景很脏，鞭毛不易被观察到，影响实验效果。⑤加B染液后，将玻片稍加热（但不能太热，更不能沸腾或蒸干）使其微冒蒸汽，30～60 s，染色效果较不加热为好。⑥B染液染完后，用蒸馏水冲洗比用自来水冲洗效果好。