肺炎链球菌荚膜缺陷菌株的构建及功能研究

【Abstract】AIM：To construct galU-deletion mutant of streptococcus pneumoniae and get the capsule deficient strain, which can be used in pneumococcal functional genome research. METHODS:  LFHPCR was introduced to generate a gene disruption construct consisting of Emr cassette with long flanking homology regions to the target gene. The streptococcus pneumoniae was then transformed directly with this PCR product. The galUdeletion mutant was obtained on the TSA agar containing erythromycin and identified by PCR. The deficient strain (5×106 CFU) was applied to infect BALB/c mice to determine the virulence. RESULTS:  GalU gene was replaced completely by erm cassette. The mutant had low virulence to BALB/c mice. CONCLUSION:  The galUdeletion mutant can be used to screen in vivopromoter in streptococcus pneumoniae because it is incapable of synthesizing capsular polysaccharide and hence loses virulence. The target gene can be replaced completely by LFHPCR product, so this method is simple, rapid and effective for functional genome research of streptococcus pneumoniae.

　　【Keywords】  streptococcus pneumoniae；polysaccharides ,bacterial；mutation；polymerase chain reaction

　　【摘要】目的：  galU基因是肺炎链球菌荚膜合成的关键基因，构建该基因的缺失突变体，获得肺炎链球菌荚膜缺陷菌株，研究其生物学功能，并为肺炎链球菌功能基因组研究提供实验菌株和技术平台. 方法： 采用长臂同源多聚酶链式反应（LFHPCR）方法制备中间为红霉素耐药基因（erm），两侧为galU基因上、下游同源序列的连接片段，并将此片段转化入肺炎链球菌，在含红霉素的血平板上筛选出缺陷菌株.用PCR鉴定缺陷菌株，小鼠实验研究其毒力.结果： PCR结果显示galU基因完全被erm基因所替代，小鼠毒力实验表明缺陷菌株毒力显著下降.结论： galU缺失突变体在小鼠体内不能形成荚膜导致其难以在小鼠体内存活，可作为筛选肺炎链球菌体内诱导启动子的宿主菌.用LFHPCR作基因突变，可完全替代靶基因，简便、快速，是肺炎链球菌功能基因组研究的一种有效的方法.

　　【关键词】 链球菌，肺炎；多糖类，细菌；突变；聚合酶链反应

　　0引言

　　肺炎链球菌（streptococcus pneumoniae,S.pn）是一种常见的条件致病菌，可引起肺炎、中耳炎、菌血症、脑膜炎等严重疾病.荚膜多糖的合成是一个多基因参与的过程，S.pn染色体上有关荚膜合成的基因位于dexB 和 aliA 基因的之间，形成操纵子结构（cap operon），参与型特异性荚膜的合成（据此可将S.pn分为90多个血清型），但是在荚膜操纵子外还存在一些基因对荚膜的合成非常重要［1］.有研究表明在所有S.pn中都存在galU基因，其编码的UDP葡萄糖焦磷酸化酶（UDPG：PP）是荚膜多糖生物合成过程中的关键酶［2］.研究证实肺炎链球菌galU基因不是细菌生存所必需的基因［3］，为可以成功构建其突变株提供了理论依据.基因缺失技术是目前研究基因功能的最佳方法，这里我们采用基于LFHPCR（long flanking homology polymerase chain reaction）方法失活肺炎链球菌galU基因，从而获得S.pn荚膜缺陷菌株，并对该突变株进行初步的研究.

　　1材料和方法

　　11材料

　　S.pn血清3型CMCC 31203购自中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保存中心.培养基： C+Y半合成培养基，含5 g/L Yeast提取物（lacks and hotchkiss，1960）；TSA血平板，含50 mL/L兔脱纤维全血.雌性BALB/c小鼠，体质量18~22 g，购自第三军医大学动物中心.S.pn CPM8染色体DNA（含有红霉素抗性基因erm）、感受肽刺激肽（CSP），由美国Morrison DA教授惠赠.胶回收试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司.PCR试剂购自上海生物工程技术服务有限公司.引物由上海生物工程技术服务有限公司合成，序列如下：
Primer〖〗Sequence 5′3′P1〖〗GTTGAAACTGCTGGTGCTCTTAAP2〖〗TGCTTTCACTTTATTATCTTGGP3〖〗ATCAAACAAATTTTGGGCCCGGTCCGTGATAAATAACTTGGTAAP4〖〗TCGTTAAGGGATCAACTTTGGGATTTTCTTTCAACTTCGTCACATDAM212〖〗CCGGGCCCAAAATTTGTTTGATDAM213〖〗AGTCGGCAGCGACTCATAGAATGP1〖〗CCCTCTAGAGAAAGGATTTTTATGAGP2〖〗TTTGGATCCTTATCTTTTTATTTTATTC

　　12方法

　　121S.pn 31203菌株制备按S.pn基因组DNA经典提取方法［4］制备： S.pn 31203菌株基因组DNA.

　　122连接片段的制备首先用PCR分别扩增出galU基因的上（P1，P3）、下游片段（P4，P2）和erm基因，引物P3、P4分别带有22~23个与erm基因5′，3′端两侧互补的碱基，这样扩增出的上、下游片段就分别带有一段与erm基因互补的序列；胶回收3个片段，并定量；再通过PCR用外侧引物（P1，P2）将这3个片段连接起来.胶回收连接片段，一份用于转化，一份送生工测序部测序.

　　123S.pn实验室转化取-70℃保存的31203菌株500 μL培养于CTM培养基（10 mL C+Y中含1 mmol/L的CaCl2和2 g/L BSA）中，当细菌达到一定菌密度时（A550nm=009），加入CSP和连接片段，37℃孵育90 min，然后铺于含红霉素（025 mg/L）的TSA上，37℃孵箱培养24～48 h，挑取血平板上的转化菌落，于含红霉素（025 mg/L）的C+Y中增菌，保存并提取DNA.

　　124缺陷菌株的PCR鉴定分别以203野生菌株、galU缺陷菌株染色体DNA为模板，PCR扩增galU基因（GP1，GP2）和erm基因（DAM212，DAM213）l

　　125缺陷菌株的生长分别挑取野生菌和缺陷菌的单个菌落接种于C+Y培养基中，37℃培养12 h，转接于20 mL C+Y培养基中，37℃培养，定时测定A620nm的吸光度.以吸光度为纵坐标，时间为横坐标绘制细菌的生长曲线.

126小鼠毒力实验将S.pn培养于C+Y培养基中，到其A620nm>05，然后用无菌PBS稀释成5×1010CFU/L，分别在BALB/c小鼠的腹腔内注入01 mL菌液，每12~13只为1组，1组注射野生菌株（13只），另1组注射缺陷菌株（12只），记录小鼠死亡时间，可得到半数致死时间.

　　2结果

　　21PCR扩增3个片段（Fig 1）galUUP（462 bp），galUDW（490 bp），erm（780 bp）.LFHPCR连接3个片段（Fig  2）： UPermDW（约1700 bp）.测序结果显示3个片段连接正确.

　　22galU基因缺陷菌株的PCR鉴定缺陷菌株含erm基因（780 bp）而野生菌株无erm基因；缺陷菌株galU基因缺失，野生菌株galU基因为892 bp（Fig 3）.

　　23缺陷菌株的生长液体培养基中缺陷菌株与野生株的生长趋势基本一致（Fig 4），表明galU基因缺陷后未明显影响细菌的生长.但缺陷菌株在体外的生长方式与野生株有所不同： 在TSA血平板上为粗糙菌落，而野生株为光滑菌落；在液体培养基中呈沉淀生长，而野生株呈悬浮生长.

　　25小鼠毒力实验野生菌株半数致死时间为15 d，而缺陷菌株在处理后2 wk未见发病死亡,半数致死时间>14 d（Fig 5）.

　　3讨论

　　荚膜多糖是S.pn主要的毒力因子，失去荚膜的菌株毒力可下降105倍 ［5］.而galU基因作为荚膜多糖生物合成的关键基因，缺失突变后在体内不能形成荚膜，容易被体内免疫细胞清除，该实验组的小鼠均无发病死亡，证实其毒力显著下降.同时对注射野生菌的发病小鼠腹腔印片镜检发现大量有宽大荚膜的S.pn，而缺陷株镜检结果显示腹腔有大量吞噬细胞聚集，S.pn已被清除.对小鼠血培养结果显示，经腹腔注射的野生菌可入血引起菌血症，缺陷株则失去入血能力.利用该突变体在小鼠体内不能存活，不能入血的特性为我们接下来应用体内表达技术（in vivo expression technology,IVET）来筛选S.pn体内诱导启动子提供了实验菌株.即把它作为宿主菌，用无启动子的galU基因报告体内诱导的启动子.

替代失活则是构建两侧为目的基因同源序列，中间为耐药基因的断裂片段，转化宿主菌，通过同源重组，使目的基因完全被耐药基因替代掉.经典的基因替代策略需要将靶基因上、下游同源序列和耐药基因依次克隆到质粒上，构建同源重组载体，再转化宿主菌.由于酶切位点的存在可能对同源重组效率有一定的影响，为了提高重组效率，有时还要将载体线形化 ［6］，采用PCR的方法制备断裂基因片段是近年来发展起来的一种基因替代失活的有效方法.根据两侧同源序列的长短不同有SFHPCR（short flanking homolology polymerase chain reaction）和LFH-PCR两种策略，SFHPCR产物仅含40~45 bp的同源序列，而LFHPCR产物的同源序列>250 bp，有的甚至达到1500 bp［7］，因此LFHPCR产物的同源整合几率比SFHPCR高［8］.实验中我们发现耐药基因与两侧片段的长度比例对于转化效率有影响，我们采用红霉素耐药基因（约780 bp）作为替代基因的转化率比用四环素耐药基因（tet，约1500 bp）要高，而且替代的靶基因不同，同源重组的效率有差异.在可发生自然转化的几种细菌中，S.pn的转化效率最高，我们研究小组已建立起S.pn稳定的实验室转化模型［9］，利用LFHPCR策略可方便地构建目的基因的缺失突变体，galU缺陷菌株的构建成功为进一步研究S.pn致病基因的功能奠定了良好的基础.

作者：孟江萍，尹一兵，袁军，张雪梅，蓝锴，陈淑惠，王虹，涂植光

　　【参考文献】

　　［1］ Garcia E, Llull D, Lopez R.Functional organization of the gene cluster involved in the synthesis of the pneumococcal capsule［J］.Int Microbiol, 1999;2(3):169-176.

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　　［3］ Thanassi JA, HartmanNeumann SL, Dougherty TJ, et al. Identification of 113 conserved essential genes using a highthroughput gene disruption system in Streptococcus pneumoniae［J］. Nucl Acids Res,2002 ;30(14):3152-3162.

　　［4］ Pearce SJ, Yin YB, Masure HR. Genetic identification of exported proteins in Streptococcus pneumoniae［J］. Mol Microbiol ,1993;9(5):1037-1050.

　　［5］ Kelly T, Dallard JP, Yother J. Effect of genetic swithing of capsular type on virulence of Streptococcus pneumoniae［J］. Infect Immun, 1994;62:1813-1819.

　　［6］ Pestova EV, Morrison DA. Isolation and characterization of three Streptococcus pneumoniae transformationspecific loci by use of a lacZ reporter insertion vector［J］. J Bacteriol, 1998 ;180(10):2701-2710.

　　［7］ Kuwayama H, Obara S, Morio T, et al. PCRmediated generation of a gene disruption construct without the use of DNA ligase and plasmid vectors［J］. Nucl Acids Res, 2002 ;30(2):2.

　　［8］ Wach A. PCRsynthesis of marker cassettes with long flanking homology regions for gene disruptions in S. cerevisiae［J］. Yeast,1996;12(3):259-265.

　　［9］ 张雪梅，尹一兵，朱旦，等. 肺炎链球菌实验室转化模型的方法学研究. 临床检验杂志，2003 ;21(4):63-65.

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