食源性病原菌检测方法研究进展

摘要食品中的病原微生物是影响食品安全的主要因素之一,传统检测食源性病原菌的方法繁琐复杂、周期较长,随着分子生物学技术和微电子技术等的发展,快速、简便、特异的检测方法成为研究目标。介绍并分析了几种检测食源性病原菌的方法及其特点,并就其发展历程和应用进行阐述。
　　关键词食源性病原菌;食品安全;检测方法
　　AbstractPathogenic microorganism is one of the most primary factor which impacts on food safety. The traditional methods for detection of foodborne pathogens are quite complicated,and exhaust a considerable amount of time. With the development of molecular biology and microelectronic technique,the detection technology which is fast,simple and specific becomes the research target. Several methods and feature for detection the foodborne pathogens were introduced and analyzed. Then its developmrent history and application were elaborated.
　　Key wordsfoodborne pathogens;food safety;detection technology
　　
　　农产品和食品安全是全球性问题,食源性疾病是食品安全的主要问题,世界卫生组织将其定义为:“凡是通过摄食进入人体的,使人体患感染性或中毒性的疾病。”这里包括了由食品微生物污染和化学性物质引起的食源性疾病。而微生物引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。近年来,国内外食源性疾病事件频频发生,如英国的疯牛病、日本的雪印牛奶金黄色葡萄球菌中毒事件,法国的多起因食用李斯特菌感染的熟肉制品而引发的食物中毒事件,全世界每年发生食源性疾病的有数十亿人,每年约有200万儿童死于腹泻。其中66%以上是由细菌性病原菌所致。其中动物源性食品中沙门氏菌、大肠杆菌O157、副溶血弧菌、单增李斯特菌等引起的食源性疾病是食品安全的主要问题。因此,对食源性疾病的预防与控制已引起了世界各国关注。其中,食源性病原微生物的检测技术是预防与控制食源性疾病的关键技术环节。传统微生物检验方法的最大弱点是耗时较长,难以满足食品生产厂家特别是出口厂家检测期较短的需求。目前国内外学者进行了大量的研究,在以抗体和核酸为基础的检测方法方面不断取得进展,现将当前国内外实际应用的食源性病原微生物检测主要技术简要介绍如下。
　　1以免疫学反应为基础的检测技术
　　1.1免疫荧光标记
　　1.1.1原理与特点。免疫荧光技术是标记免疫技术中发展最早的一种。它以荧光素作为一种标记物标记抗体,依据荧光素所发出的荧光在荧光显微镜下对抗原进行细胞定位,确定抗原性质,并利用定量技术测定含量。该法把血清学的特异性、荧光色素的敏感性集为一体,因此具有特异性强、敏感性高、速度快的优点。主要缺点是非特异性染色问题尚未完全解决,使结果判定的客观性不足,技术程序也还比较复杂[1]。
　　1.1.2应用。始创于20世纪40年代初,1942年Coons等首次报道用异氰酸荧光素标记抗体,检查小鼠组织切片中的可溶性肺炎球菌多糖抗原。直至1958年Riggs等合成了性能较为优良的异硫氰酸荧光素,Marshall等又对荧光抗体标记的方法进行了改进,从而使免疫荧光技术逐渐推广应用。1994年我国科学家孙洋等人成功利用此法检测沙门氏菌。
　　1.2酶联免疫吸附测定
　　1.2.1原理与特点。酶联免疫吸附测定是把抗原抗体的免疫反应和酶的高效催化作用原理结合起来的一种检测技术,通过显色进行定位和定量分析。具有检测灵敏度高、特异性强、准确性好、样品处理量大等特点,而且可与其他技术偶联而衍生出适用范围更广的新方法。
　　1.2.2应用。1971年Engvall和Perlmann发表了酶联免疫吸附剂测定用于IgG定量测定的文章,使得酶标抗体技术发展成液体标本中微量物质的测定方法。Kryinski和Heimsch(1977)首次将ELISA用于食品沙门氏菌的检测,并在应用中不断得以发展,20世纪80年代Paadhye和许多学者都采用了ELISA进行食品沙门氏菌的检测,但他们使用的多价血清不同程度地存在交叉反应,使ELISA产生较多的假阳性,在实践中有一定的困难。20世纪80年代,单克隆技术问世和日趋成熟,文其乙等人(1995)在前人的基础上应用沙门氏菌属特异性单克隆抗体CB8和DE7建立了检测沙门氏菌的直接ELISA方法,并形成了快速检测试剂盒,已被应用于各种畜禽疾病诊断和环境样品的检测,成为一种常规的检测方法。但到目前为止,大多数用于直接ELISA的抗体只具有属特异性。
　　1.3免疫磁珠分离法
　　1.3.1原理与特点。免疫磁性分离技术是将特异性抗体偶联在磁性颗粒表面,与样品中被检致病菌发生特异性结合,载有致病菌的磁性颗粒在外加磁场的作用下,向磁极方向聚集,弃去检样混合液,使致病菌不断得到分离、浓缩,是从食品成分中分离靶细菌非常有效的方法。若能和其他检验方法如ELISA、PCR、FIA相结合,则可数倍地提高分离效率和检测范围。
　　1.3.2应用。如利用IMS技术对环境水样本进行检测,不进行过滤等预处理,能快速有效地探测环境中水的E.coli O157:H7,最低检测限可达2×103个细胞/mL;利用IMS-PCR法,可在7 h内在5~100 L样本中检测也至少1个C.parvum卵囊,该方法的快速性和灵敏性足以使其胜任饮用水中C.parvum污染的常规检测。在英国,此法主要应用于牛奶中E.coli O157:H7的监测和食品中单增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、小肠结肠耶尔森氏菌等的检测。

1.4免疫金技术
　　1.4.1原理与特点。胶体金标记抗体,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。增菌的阳性样品沿着膜移动,被固定的载有染色剂的抗体将使抗原—抗体复合物着色,显色程度与抗原含量成正比。其特点是灵敏度和特异性都较高,且操作简便、快速,无污染,易于判读。用于定性或半定量的快速免疫检测方法中。金标免疫快速试验的灵敏性与ELISA基本相近,许多试验的敏感度都可达到1 ng/mL或更低水平,但是有些试验则不能达到如此的敏感度,采用信号放大系统如生物素—链亲和素系统,应用链亲和素与生物素结合的四价性和极高的亲和常数,可明显提高灵敏度和稳定性[2]。
　　1.4.2应用。1971年Faulk和Taytor将胶体金引入免疫化学,将抗沙门氏菌抗体与胶体金结合,用直接免疫细胞化学技术检测沙门氏菌的表面抗原获得成功。进入20世纪90年代,它已在生物医学各领域得到日益广泛的应用。目前有专门用来检测食品及环境中沙门氏菌抗原、李斯特菌抗原的商品化检测卡。
　　2分子生物学检测方法
　　聚合酶链反应(PCR)是近十多年来应用最广的分子生物学方法,在食源性致病菌的检测中均是以其遗传物质高度保守的核酸序列设计特异引物进行扩增。其大量研究表明,PCR在对食品中病原微生物的确证试验方面与传统培养方法相比至少具有相同的灵敏度,而多数情况下则表现出更高的灵敏度,阳性检出率更高[3],而且检测周期大为缩短。在PCR的不断发展和应用中,以其为基础的更多方法技术涌现出来,其中,多重PCR、 DNA指纹图谱技术、荧光PCR、基因芯片技术、定量PCR等检测技术应用最为广泛。
　　目前部分常见食源性病原微生物的PCR检测已有相应的商品试剂盒出售。主要有:BioControl公司的肉毒梭菌、大肠杆菌0157:H7、李斯特菌、沙门氏菌PCR检测试剂盒(商品名Probelia)和Qualicon公司的大肠杆菌0157:H7、李斯特菌、沙门氏菌PCR检测试剂盒(商品名BAX)等。
　　2.1多重PCR检测技术
　　2.1.1原理与特点。多重PCR的建立,实现了多种食源性致病菌的同时检测。多重PCR是指在同一个反应体系中,加入多对特异性引物,如果存在与各引物对特异性互补的模板,即可同时在同一反应管中扩增出1条以上的目的DNA片段,达到一次性检测多种致病菌的目的。多重PCR既保留了常规PCR的特异性、敏感性,又减少了操作步骤及试剂使用量[4]。但也存在明显的不足,例如扩增效率不高、敏感性偏低;扩增条件需摸索与协调;可能出现引物间干扰等。
　　2.1.2应用。Franket等[5]首先将多重PCR方法检测产毒素性大肠杆菌基因。现多重PCR方法已被用于同步检测大肠杆菌、沙门氏菌、致病性弧菌等[6],鉴定与肠毒素有关的金黄色葡萄球菌菌株[7],研究李斯特菌种内分化等,结合富集培养,应用多重PCR方法甚至可以同时检测13种不同的食源性病原微生物。
　　2.2DNA指纹图谱技术
　　2.2.1原理与特点。DNA指纹图谱是指能够鉴别生物个体之间差异的DNA电泳图谱,使目标微生物的核酸经PCR扩增后产生多条DNA扩增片段,这种电泳图谱多态性丰富,具有高度的个体特异性和环境稳定性。指纹图谱是鉴别菌种、种属的有力工具,具有快、准确等优点。其中包括随机引物扩增多态性DNA分析(Random Amplified Polymorphism DNA,RAPD),主要用于不考虑微生物核酸精确序列的情况下,比较微生物间的DNA指纹图谱差异,用于细菌种间的鉴定、微生物的分子分型和鉴定。
　　2.2.2应用。国内有的机构采用RAPD技术对肠炎沙门菌进行分子分型,先将肠炎沙门菌接种SS平板并取其菌液作为RAPD多态性分析的DNA粗制模板,然后利用引物5’-CCGCAGCCAA-3’对菌株进行RAPD扩增反应并经过凝胶成像系统获得RAPD图像,再用软件计算扩增片段的分子量大小和系统聚类分析。该方法为肠炎沙门菌食源性疾病的流行病学调查和溯源的同源性分析提供了技术支持。但是RAPD的不足之处是需对大量的随机引物进行筛选。
　　2.3实时荧光定量PCR
　　2.3.1原理与特点。实时荧光定量PCR技术是指在PCR反应体系中在探针上加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃,是迄今为止定量最准确、重现性最好的定量方法,且自动化程度高,目前已得到广泛应用。
　　2.3.2应用。我国科学家彭雁忠等(2005)已建立了一种能同时检测空肠弯曲菌(CJ)、肠出血性大肠杆菌(EHEC)O157:H7、副溶血性弧菌(VP)和单核增生李斯特菌(LM)的多联实时荧光PCR定量方法。
　　2.4DNA芯片技术
　　2.4.1原理与特点。DNA芯片是将大量寡核苷酸分子固定于固相支持物上组成的微点阵列。其检测致病菌原理为:选择细菌的共有基因(16SrDNA、23SrDNA、ERIC)作为靶基因,用1对通用引物进行扩增,再利用芯片上的探针检测不同细菌在该共有基因上的独特碱基。最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式区分不同的细菌,此法还可以通过向寡核苷酸探针阵列中添加相应的探针来逐步扩大基因芯片的检测范围。并通过增加和调整探针来逐步提高基因芯片的准确性。在食品卫生质量检验、临床疾病诊断方面微阵列基因芯片的开发具有广阔的应用前景[8]。
　　2.4.2应用。Carl等[9]在对4种细菌,即大肠埃希菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌和空肠弯曲菌采用基因芯片的检测方法,其检测结果不仅敏感度高于传统方法,而且操作简单,重复性好,并且节省了大量时间,大大提高了4种细菌的诊断效率。2001年,Call等[10]利用多重PCR和基因芯片技术成功检测了大肠杆菌O157:H7。聂萌(2006)运用通用芯片技术平台建立了快速、准确、高通量检测食源性致病菌的方法。然而,基因芯片技术还有许多地方待改进,如检测成本高昂,检测特异性有待提高,样品制备过程应该进一步简化以及建立标准化程序等。
　　3生物传感器
　　3.1原理与特点
　　生物传感器主要由分子识别的固定化生物敏感膜和转换信号的换能器2部分组成。当待测物质经扩散作用进入固定化敏感膜时,发生生物学反应,产生的信息被相应的转换器转变成可定量和可处理的电信号,并经仪表放大输出,以电子计算机处理后,即完成对产生信号的检测,由此获得待测物质的种类及浓度。与传统的化学传感器和离线分析技术相比,生物传感器有着许多不可比拟的优势,如高选择性、高灵敏度、较好的稳定性、低成本,可微型化、便于携带、可以现场检测等。
　　3.2应用
　　乌普迪克等(1967)制出了第1个生物传感器葡萄糖传感器。在第2代生物传感器(微生物、免疫、酶免疫和细胞器传感器)的基础上,国内外学者正研制和开发第3代生物传感器,是将生物技术和电子技术结合起来的场效应生物传感器。Liu等[11]用光学免疫传感器实现了鼠伤寒沙门氏菌的快速检测。Geng等[12]采用了以抗体为基础的光纤免疫传感器对热狗和腊肠内少量的单增李斯特菌进行检测,检测低限为10~1 000 cfu/g,可在24h内完成。在现场快速检测领域,生物传感器技术与比色、免疫胶体金试纸、ELISA等检测方法相比还未得到普遍应用,但国内外对这方面的报导很多,各种新技术如纳米、分子印迹为其提供了丰富的发展空间,随着检测仪器和检测方法的不断成熟,生物传感技术在食品现场快速检测领域将有更广阔的应用前景。

4讨论与展望
　　长期以来,国内外不少实验室对微生物标本的检测方法做了进一步的改进和发展,但是还是从纯培养的观念出发,应用各种培养基,进行分离培养、形态检查、生化反应和动物实验等,尽管解决了不少问题,但其浪费人力、物力,而且需要2~3 d甚至更长的时间才能检测结果,以致失去了对临床工作的指导意义,从而不同程度地影响着它的使用价值。为此国内外该领域的研究人员都颇为重视应用免疫学技术、分子生物学技术和分子遗传学技术与微型计算机相结合或以此为基础拓展新方法,对细菌等各类微生物标本进行快速检验研究。这样在检测标本的过程中,既无需进行分离微生物或作纯培养,也不需要作生化实验等,而是应用上述技术对标本直接做检测,以确定在标本内是否含有活细菌、细菌产物或抗原成分,定性并定量检测,而且在2~3 h左右即可报告检测结果,及时做出确切诊断。
　　免疫学方法一般需提供数量较多的纯化细菌,或需对样品进行浓缩后收集,以提高单位体积的含菌量,从而较难在短时间内得到检测结果。但它不需要复杂仪器,所需设备简单、易操作。在测定抗体的试验中ELISA的阳性率与常规方法相似但测出抗体的时间较早,抗体滴度也较高,但在检测抗原时,其敏感性尚不能完全令人满意,说明该法还有进一步改进的必要。其中免疫胶体金快速诊断技术由于其无污染、便捷、灵敏、安全等特点,对致病菌的检测研究有广阔的应用前景。若能实现多元化,在同一膜上固定多种反应物,1次测定可同时得到1组结果,这对于检测某些具有联检意义的物质具有很大的应用价值。但总体来看,快速检测方法有时在卫生检验方面目前尚存在定性与精确定量难以兼顾的状况。另外,每一种免疫学检测模式都存在抗体与非抗原物质之间的非特异性反应,从而产生假阳性反应。此外,待检抗原被样品中一些物质或其他优势菌群所掩蔽,会产生假阴性反应。为了避免这些误差,可设置对照实验进行证实。随着分析化学技术的发展,很多仪器分析手段和方法如高效液相色谱(HPLC)、气相色谱(GC)、气相色谱—质谱联用(GC-MS)、液相色谱—质谱联用(LC-MS/MS)等,已显示出在微生物检测中的潜力。这些方法不同于依赖微生物生物学特征的检测方法,而是通过分析微生物的化学组成(生物标志物)来区分和鉴定微生物,开辟了检测和鉴定微生物的新途径。

作者：孙晓飞 赵凯 王金斌 谭芙蓉 祁保民 唐雪明《现代农业科技》
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