大肠埃希菌多重耐药与Ⅰ类整合子的关系

【摘要】  目的 监测大肠埃希菌临床分离株的耐药性，了解大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的流行情况和分子特性。方法 临床分离114株大肠埃希菌经全自动细菌分析系统鉴定并检测耐药性，应用PCR法扩增质粒DNA上Ⅰ类整合子，对PCR产物进行酶切分析和DNA测序。将序列结果在GenBank中搜索，确定Ⅰ类整合子可变区基因盒的种类和排列。结果 细菌耐药率>50%，且大多为多重耐药菌(耐受3种以上抗生素)。在58株细菌的质粒DNA上检测到Ⅰ类整合子序列，大小约600~3 500 bp，各含1~3个Ⅰ类整合子。整合子中最常见的基因盒为dfrl7(甲氧苄啶耐药基因)与aadA5(链霉素、壮观霉素耐药基因)，最主要的基因盒排列为dfrl7-aadA5。绝大多数携带甲氧苄啶耐药基因盒的菌株对复方新诺明耐受，大多数携带链霉素、壮观霉素耐药基因盒的菌株对链霉素不敏感。结论 目前临床分离的大肠埃希菌耐药性强，并广泛存在Ⅰ类整合子。菌株携带基因盒和耐药表型之间有较好的对应关系，基因盒介导了细菌耐药性。细菌的多重耐药率与Ⅰ类整合子的阳性率相关。

【关键词】  大肠杆菌O157;药物耐受性; 整合子类;基因, 细菌; 抗菌药

大肠埃希菌是引起人类感染最常见的肠杆菌科细菌[1]，其耐药形势十分严峻。细菌耐药性通常由获得耐药基因引起，耐药基因的水平传播使耐药菌株广泛流行[2]。整合子是耐药基因水平转移的主要因子，是含有位点特异重组系统和基因盒的遗传结构，也是一个基因盒整合和切除系统，包括对基因盒的捕获、切除和表达[3]。整合子根据整合酶的不同而分类，其中Ⅰ类整合子最常见，本研究分析大肠埃希菌中Ⅰ类整合子的流行情况和分子特性。

　　1 材料与方法

　　1.1 菌株 于2005年10月-12月自福建省立医院各科室临床标本中分离大肠埃希菌114株，细菌经全自动细菌分析系统(Vitek 2，美国BioMerieux)检测并进行22种抗生素敏感性测定。对四环素、氯霉素、链霉素、萘啶酸的耐药性用纸片法测定。

　　1.2 方法

　　1.2.1 PCR试剂及反应条件 用碱裂解法制备PCR模板质粒DNA，Ⅰ类整合子的引物序列：

　　上游：5'-GGC ATC CAA GCA GCA AG-3'

　　下游：5'-AAG CAG ACT TGA CCT GA-3'

　　PCR反应体系：模板1 μL，上下游引物(l0 μmol/L)各1 μL，dNTP(200 μmol/L)2 μL，10×buffer，MgCl2(25 mmol/L)2.5 μL，Taq DNA 聚合酶(5 U/μL)0.125 μL，超纯水17.375。反应条件：预变性94 ℃ 6 min→变性94 ℃ 30 s→退火60 ℃ 1 min→72 ℃ 2 min，35个循环;延伸72 ℃ 10 min。对扩增产物进行琼脂糖电泳检测。

　　1.2.2 限制性内切酶反应 HinfI(10 U/μL,TakaRa)，酶切反应体系：PCR产物6 μL，10×酶切缓冲液1 μL，Hinfl(10 U/μL)0.5 μL，超纯水2.5 μL。37 ℃反应14 h，加入1 μL 10×酶切缓冲液终止反应，对酶切产物进行琼脂糖电泳检测。

　　1.2.3 PCR产物测序 PCR产物的纯化及测序由大连宝生物工程有限公司完成。

　　1.3 统计学处理 数据以SPSS 11.5统计软件处理，采用χ2检验，细菌多重耐药率和整合子阳性率进行显著性检验，P<0.05为差别有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 大肠埃希菌的鉴定和药敏 114株大肠埃希菌经BioMerieux全自动细菌分析仪鉴定，对26种抗生素的敏感性试验结果分析，细菌对其中12种抗生素的耐药率>50%，耐药率高的抗生素包括氨苄青霉素(100%)、复方新诺明(80%)、氨苄西林/舒巴坦(80%)、左旋氧氟沙星(64.8%)庆大霉素(60%)等;中介率最高的为妥布霉素(40%);敏感率最高的是亚胺硫霉素(亚胺培南，100%)。

　　2.2 Ⅰ类整合子的检测结果 对114株大肠埃希菌进行Ⅰ类整合子的扩增，阳性58株，PCR产物的大小分别为600，1 000，1 600，2 000，2 500，3 500 bp各株细菌含1～3个Ⅰ类整合子。根据各株细菌质粒DNA上检测到Ⅰ类整合子的大小和数目，细菌质粒DNA上的整合子可分为10种整合子谱(表1，图1)。表1 Ⅰ类整合子谱

　　1-9:不同类型的Ⅰ类整合子;10:200 bp DNA ladder

　　2.3 Ⅰ类整合子中基因盒分析 选择600，1 000，1 600，2 000 bp的Ⅰ类整合子送公司进行纯化及测序。将测序结果在GenBank中用Blastn进行核酸序列搜索，各整合子中所含基因盒种类和排列见表2。600，1 000，1 600 bp整合子序列与GenBank中序列号为AY748452.1、AB154408.1、DQ663488的核酸序列相同。表2 各整合子所含的基因盒种类和排列

　　携带基因盒dfr17的47株细菌中，40株对复方新诺明耐药，携带基因盒aadA2或aadA5的47株细菌中，39株对链霉素耐药，携带基因盒acc(6')的2株细菌对庆大霉素、妥布霉素均耐药，说明细菌的耐药表型与其携带的基因盒有很好的对应关系。有4株携带dfr17-aadA5基因盒的菌株对链霉素敏感，这种现象可能是由于耐药基因的低水平表达或沉默引起的[4]。

　　2.4 酶切结果 对于电泳检测为大小相同的Ⅰ类整合子，选用内切酶HinfI对Ⅰ类整合子进行酶切，并对酶切产物进行电泳检测分析。结果发现，3个600 bp，3个1 000 bp，44个1 600 bp，2个2 000 bp的整合子分别是相同的DNA序列(图2)。

　　2.5 Ⅰ类整合子与多重耐药的关系 Ⅰ类整合子阳性的菌株比阴性的菌株更易表观出对氨基糖苷类、喹诺酮类及第三代头孢菌素药物的耐药性，也更易介导多重耐药性，Ⅰ类整合子阳性的菌株与大肠埃希氏菌多重耐药(耐受3种以上抗生素)作统计学分析(χ2检验，χ2=9.48)，二者差别有统计学意义(P<0.05，表3)，说明细菌多重耐药与整合子有关。表3 Ⅰ类整合子与多重耐药的关系

　　3 讨 论

　　本组中114株大肠埃希菌中有58株(50.9%)携带I类整合子，整合子中最常见的基因盒为链霉素、壮观霉素耐药基因盒(aadA)，以及甲氧苄啶耐药基因盒(dfr17)。原因是： 链霉素、壮观霉素在食源性动物饲养中还广泛使用，所以人类可以通过食物链或接触动物获得相应基因盒的整合子[5]。 甲氧苄啶在泌尿道感染的治疗中，作为一线药物使用，造成甲氧苄啶的选择性压力很大[6]。 aadA和dfr两个基因家族与整合子关系最密切，是整合子介导的最常见的抗药基因型[7]。实验观察到细菌携带基因盒与其耐药表型有很好的对应关系，这充分说明了基因盒中的耐药基因介导了细菌相应的耐药性，整合子在介导细菌耐药性方面发挥着重要作用，因此监测临床分离株整合子的耐药基因盒对指导临床用药有一定作用。

　　Ⅰ类整合子阳性菌的耐药率高于阴性菌株,整合子阳性的菌株对抗生素的多重耐药率也显著高于整合子阴性的菌株，整合子阳性的菌株更易表现出对青霉素类、磺胺类、喹诺酮类的多重耐药。说明多重耐药菌在院内的暴发流行与其携带的整合子有关。

整合子具有通过位点特异重组机制整合多个耐药基因盒的能力[8]。医院环境下的临床菌株在更大的抗生素选择性压力下，耐药基因盒更容易被整合子捕获和积聚。目前，几乎每一类抗生素的耐药基因盒都被发现，但世界各地均发现耐药基因盒主要与传统抗生素相关，如链霉素、甲氧苄啶、早期的氨基糖苷类药物。然而，新抗生素的耐药基因盒己经出现，如blaIMP(编码对亚胺培南、广谱β-内酸胺类抗生素的耐药性)、aacA7(编码对新氨基糖昔类药物如阿米卡星、奈替米星的耐药性)，这些基因盒还没有获得足够的选择压力或时间广泛传播，而整合子具有强大的捕获和积聚基因盒的能力，可能不久将使这些新抗生素的耐药基因盒流行[5]。因此，整合子将继续影响抗生素的有效性。

作者：陈婉花， 伍严安， 胡辛兰， 吴长生， 李宁《福建医科大学学报》

【参考文献】
  　[1] 李 华,马筱玲. 临床分离大肠埃希菌耐药性检测[J]. 安徽医学,2007(1):72-73.
　　[2] 杨仁国,吕晓菊. 整合子系统与细菌多重耐药研究进展[J].中国抗生素杂志，2008，33(4):198-202.
　　[3] 陈红英,胡功政,李新生,等. 整合子与细菌多重耐药性[J]. 动物医学进展，2006，27(4)：29-32.
　　[4] Severino P,Magalhaes V D. The role of integrons in the dissemination of anti- biotic resistance among clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa from an intensive care unit in Brazil[J]. Res Microbiol, 2002,153(4):221-226.
　　[5] Ribera A,Vila J,Fernandez-Cuenca F,et al. Type 1 integrons in epidemiologi-cally unrelated Acinetobacter baumannii isolates collected at Spanish hospitals[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2004,48(1):364-365.
　　[6] Maguire A J,Brown D F,Gray J J,et al. Rapid screening technique for class 1 integrons in Enterobacteriaceae and nonfermenting gram-negative bacteria and its use in molecular epidemiology[J]. Antimicrob Agents Chemother, 2001,45(4):1022-1029.
　　[7] 石 磊,陈 洵,肖增磺. 多重耐药临床菌株中整合子结构的监测与分析[J]. 中国抗生素杂志,2007,32(1):43-48.
　　[8] Daly M,Buckley J,Power,E,et al. Molecular characterization of Irish Salmonella enterica serotype typhimurium:detection of class I integrons and assessment of gene-tic relationships by DNA amplification fingerprinting[J]. Appl Environ Microbiol, 2000,66(2):614-619.

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