酵母菌发酵川乌、附子的初步研究

【摘要】  目的探讨酵母菌发酵对川乌、附子(黑顺片)中总生物碱含量的影响。方法采取酵母菌直接发酵和以面粉为基质进行酵母菌扩增，之后再与川乌、附子混合两种发酵方法，水煎提取、测定总生物碱含量和浸膏得率。结果酵母菌直接发酵生物碱含量最高，酵母菌+面粉再与川乌、附子混合发酵后生物碱含量略低，但浸膏得率最高，两种方法发酵均高于传统水提法。结论酵母直接发酵川乌、附子能明显提高总生物碱含量和浸膏得率。

【关键词】  川乌; 附子(黑顺片); 酵母发酵; 总生物碱; 浸膏得率

川乌为毛茛科乌头属植物乌头的干燥主根, 具有祛风除湿，散寒止痛的功效，附子为子根，具有回阳救逆，助阳补火，散寒止痛的作用。川乌、附子两药材同源，均为临床常用品。川乌、附子的主要成分之一生物碱是祛风除湿、散寒止痛的有效成分，同时又是导致中毒的成分，由于乌头碱致毒事件频频发生，制约了乌头属中药的应用[1],《中国药典》2005 版规定川乌、草乌的用量减至35 g，以减量减毒，这种做法以疗效为代价换取用药安全。如何通过简单设备、方便操作、低成本加工保证川乌、附子的疗效，同时又降低其毒副作用，达到减毒增效是现代中药研究的主要课题之一[2]。发酵是传统中药加工的重要方法之一，发酵作为一种加工工艺不但改变煎、煮、熬、炼、蒸、浸的传统工艺，而且使药效提高、药性发生改变，在有毒药物的研究方面蕴藏着极大潜力[3]。为此本研究尝试以无毒副作用的酵母菌发酵川乌、附子，阐明此菌发酵对附子、川乌中总生物碱含量的影响，为下一步药效和毒理学研究提供理论依据。

　　1 材料与仪器

　　1.1 材料制川乌、附子(黑顺片)均购自河北安国长安药材行，经联合大学生物化学工程学院制药工程教研组鉴定为正品;安琪高活性干酵母，安琪酵母股份有限公司产品;蛋白胨、酵母浸粉、琼脂粉，北京奥博星生物技术有限责任公司产品;葡萄糖，北京化学试剂公司产品;溴甲酚绿(BCG)试液依照2005年版《中国药典》配制;乌头碱对照品，中国药品生物制品检定所产品，批号：11072-200410。

　　1.2 仪器超级洁净工作箱DL-CJ-2ND(北京东联哈尔仪器制造有限公司);立式压力整齐灭菌器LS-835L型(江阴滨江医疗设备厂);新型恒温振荡器ZHWY-2102(摇床);电热恒温鼓风干燥箱DHG-9070A型(上海一恒科学仪器有限公司);烘箱(天津市中环实验电炉有限公司);SHB-95型循环水式多用真空泵(河南省予华仪器有限公司);RE-52C旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂);DZTW调温电热套(北京市永光明医疗仪器厂);HW·SY11-K数显恒温水浴锅(北京市长风仪器仪表公司);TU-1901双光速紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)。

　　2 方法与结果

　　2.1 面粉发酵粉碎川乌、黑顺片至1020目，以少量水浸泡川乌、黑顺片粉末。取干酵母0.5 g，温水冲开，与10 g面粉混匀，平铺于培养皿，置29℃恒温培养箱发酵23 h，取出，分别与40 g川乌、40 g黑顺片、20 g川乌+20 g黑顺片粉末混合均匀，平铺于培养皿，根据预试验结果培养5 d，药材表面出现白色和黄色菌落。

　　2.2 酵母菌发酵YPD液体培养基：蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g于1 000 ml水中。

　　YPD固体培养基：蛋白胨20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g于1 000 ml水中。

　　酵母菌活化培养：固体培养基高压灭菌后，倒入平板，23 h凝固，待用。用少量无菌水溶解干酵母成膏状，挑取膏状酵母，接种后放入29℃培养箱培养3 d待用。

　　酵母菌扩大培养：挑取已活化的菌体，深入液体培养基中轻轻搅拌，于29℃摇床培养3 d，待用。

　　川乌、黑顺片发酵：无菌条件下，将活化培养的200 ml酵母菌悬液分别与高压灭菌的川乌40 g，黑顺片40 g，川乌20 g+黑顺片20 g，粉末搅拌，根据预试验放入29℃摇床培养5 d，菌悬液颜色变深。

　　2.3 提取分别取发酵前后的川乌、黑顺片各40 g，川乌20 g+黑顺片20 g，用300 ml蒸馏水煮3次，时间分别为1.5，1，0. 5 h，过滤，合并滤液,离心，取上清，减压蒸发至100 ml。分别取上述浓缩液50 ml，用氨试液调pH=9，之后依次用乙醚25 ，20，15，10 ml萃取4次，上层溶液水浴蒸干，取氯仿共5ml转移残渣至分液漏斗，以HCl(0.1 mol/L)5，5，5 ml萃取3次，合并上层液，氨试液调pH=9，再用三氯甲烷10，10，10 ml萃取3次，取下层，水浴蒸干。用0.01 mol/L HCl将残渣转移定容至10 ml容量瓶中，进行总生物碱检测。

　　2.4 总生物碱检测

　　2.4.1 乌头碱对照品溶液配制精密称取乌头碱标准品2.53 mg置10ml容量瓶，以0.01 mol/L的盐酸溶液定容，作为对照品。

　　2.4.2 检测波长确定取一定量的对照品溶液于100 ml分液漏斗中，加入pH=3.50的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液5.0 ml，BCG试液2.0 ml，氯仿10.0 ml，加适量蒸馏水使水相成10 ml，充分振摇均匀，静置1 h分层。将下层氯仿液放入装有少量无水硫酸钠的10 ml容量瓶中。另取10.0 ml氯仿置100 ml分液漏斗中,同法操作，作为空白对照，于200700 nm波长范围内进行光谱扫描。结果表明本品在412.5 nm处有最大吸收峰，在此波长下空白对照的干扰比较小。见图1。

1-样品;2-标准品;3-阴性样品

　　图1 乌头碱-BCG紫外可见光谱

　　2.4.3 标准曲线的制备精密量取乌头碱标准溶液，0.4，0.5，0.6 ，0.7，0.8，0.9 ml，分别置于干燥分液漏斗(100 ml)中，加缓冲剂5.0 ml，溴甲酚绿溶液2. 0 ml，蒸馏水定容10.0 ml，摇匀。再精密加入氯仿10.0 ml,充分振摇3 min,静置1 h后，分取氯仿液至已放入0. 5 g无水硫酸钠的试管中,放置0. 5 h。另取10 ml氯仿，置于干燥分液漏斗(100 ml)中,同法操作，作为空白对照。于412.5nm波长处进行吸光度值测定，绘制标准曲线。乌头碱标准曲线图如图所示。计算得标准曲线方程为: Y=0.002 78X+0.023 14，r=0.999 6。结果表明,在10.1222.77 μg/ml范围内线性良好。根据标准曲线计算总生物碱含量[4]。

　　2.4.4 稳定性实验准确移取对照品溶液0.8 ml，按“2.4.2”项的方法操作，在412.5 nm处，分别在0.5，1.0， 1.5，2.0，2.5和3.0 h测定不同时间段对照品溶液吸光度，并计算相对标准偏差(RSD=0.79)。见表1。表1 乌头碱-BCG络合物稳定性测定结果

　　2.4.5 重现性实验准确移取标准品溶液0.5 ml共6份，按“2.4.2”项的方法操作，于412.5 nm波长处测定吸光度值，并计算RSD=3.17%。见表2。

　　2.4.6 加样回收率实验取已知含量的样品6份，加入含量一定的乌头碱对照品溶液，按“2.4.2”项，在412.5 nm处测定其吸光度值,计算其加样回收率，结果表明，该方法的回收率在97.34%100.31%之间，平均回收率为99.27%，RSD=1.16%，表明该方法结果可靠。见表3。

　　2.5 干浸膏含量测定分别取发酵前后的川乌、黑顺片各40 g，川乌20 g+黑顺片20 g，用300 ml蒸馏水煮3次，时间分别为1.5，1，0.5 h，过滤,合并滤液,离心，取上清，减压蒸发至100 ml。按照2005年版《中国药典》Ⅰ部附录X.A浸出物测定法，各精密取提取液10 ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，水浴蒸干，于105℃烘3 h，转移至干燥器中，冷却30 min，精密称重，计算干浸膏含量，酵母菌+面粉发酵浸膏得率最高。见表4。表2 重现性测定结果

　　2.6 川乌和附子中总生物碱含量测定精密量取按“2.3”项下制备的9种提取液，按“2.4.2”项方法，在412.5 nm处测定吸光度，并计算含量。与传统水煎组比较, 酵母菌+面粉发酵或酵母菌直接发酵均能够增加各组中总生物碱的含量，在各种组合中，酵母菌直接发酵川乌+附子总生物碱含量最高0.39 mg/g，传统水煎附子生物碱含量则最低0.20 mg/g;酵母菌直接发酵川乌、附子、川乌+附子总生物碱含量均增加。在浸膏得率方面酵母菌+面粉发酵较高(39.5%)。见表4。表4 不同处理对方川乌、附子中总生物碱含量和干浸膏得率的影响

　　3 讨论

　　微生物发酵已成为中药现代化研究的重要内容之一，利用中草药发酵已从单味药涉及到复方且取得显著成果，成药片仔癀即是用麝香、牛黄、蛇胆、三七等名贵中药的微生物发酵物，为临床退黄、消肿的良药[5]。酵母无毒，生长繁殖快，培养基和培养条件简单，发酵能力强，因此本研究以川乌和黑顺片为基质进行酵母菌发酵，结果表明酵母菌发酵川乌+附子总生物碱含量(0.39 mg/g)明显高于其它组合，而两种发酵方法均高于未发酵的对照组，由此推断，酵母发酵可使川乌、附子中总生物碱含量增加。微生物可利用中药材为营养进行分裂、生长、代谢和繁殖，在代谢过程中分泌蛋白酶、纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶、淀粉酶等几十种胞外酶进入培养基，使细胞破裂，细胞间隙增加，减小细胞壁、细胞间质等传质屏障对有效成分从胞内向提取介质扩散的传质阻力，使有效成分提取率明显升高[6]。酵母菌直接发酵上述药材总生物碱增加显著，可能是因为酵母菌直接以川乌和黑顺片中的成分为营养源，发酵充分、完全，而以面粉为基质进行酵母菌扩增，之后再与川乌、附子混合发酵后总生物碱含量较酵母菌直接总生物碱含量低，因为酵母菌常生长在含糖(或盐)量较高的环境中,可优先利用面粉中的糖类为营养[7]，而对药材的利用率降低，同时加入面粉会影响生物碱的溶出，故导致其对川乌和黑顺片的利用率相对较低，酵母菌+面粉发酵组干浸膏得率最高(39.5%)，是否与加入的面粉有关有待于进一步研究，由于除沉过程对有效成分有影响，因此本研究认为酵母菌直接发酵程序简单、操作方面、总生物碱较高，值得深入研究。

微生物发酵可使中药材含量和成分发生变化，如酵母菌发酵大黄后，总蒽醌含量略有降低，结合型蒽醌含量降低，但游离型蒽醌含量增加6倍左右[8]。川乌和黑顺片中的生物碱-双酯型二萜类生物碱，如乌头碱、次乌头碱、新乌头碱，既是有效成分，也是毒性成分，双酯型生物碱经转化可分解成毒性较小的单酯类生物碱[9]。本研究酵母发酵川乌和黑顺片总生物碱增加显著，其中双酯型生物碱与单酯型生物碱的含量变化规律有待于进一步研究，如何通过优化工艺达到减毒增效、提高总生物碱含量继而开发外用止痛剂，将是本研究下一步要解决的问题。

作者：葛喜珍 刘洁 苏建树，郑来丽，李利辉，赵有玺,田平芳《时珍国医国药》

【参考文献】
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　　[3] 葛喜珍.微生物发酵在中药研究中的应用[J].时珍国医国药，2008，19(2)：386.
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　　[5] 陈海滨，吴春敏，刘洪旭.片仔癀质量标准研究[J].海峡药学，2006，18(1)：24.
　　[6] 王兴红，李旗德，曹秋娥.微生物发酵中药应成为中药研究的新内容[J].中草药，2001，32(3)：267.
　　[7] 明儒成，聂海玲，封新平.一种新组分酵母菌培养基的研制及应用[J].生物技术，2008,18(2):49.
　　[8] 戴万生，赵荣华.发酵法对大黄蒽醌类成分含量的影响[J].云南中医药杂志，2005，26(1)：38.
　　[9] Thomas Y.K. Chan. Incidence of Herb-Induced Aconitine Poisoning in Hong Kong[J]. Drug Safety, 2002,25 (11)：823.

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