160株新生儿肺炎克雷伯菌的耐药性分析

【摘要】  目的  分析我院新生儿科病区产ESBLs、AmpC酶的肺炎克雷伯菌的耐药情况，指导临床合理用药。方法  按CLSI 推荐的超广谱β内酰胺酶( ESBLs)确证试验,对肺炎克雷伯菌进行ESBLs检测,并用三维试验法、三维试验抑制试验进行AmpC酶检测。结果  160株肺炎克雷伯菌中,检到产ESBLs肺炎克雷伯菌84株，阳性率高达52.50%。71株耐头孢西丁菌株检到23株产AmpC酶，其中单产AmpC酶5株，产Ampc+ESBLs菌株18株。AmpC酶阳性率为14.38%（23/160）。结论  分离自我院新生儿科的肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗菌药物耐药严重，主要以产ESBLs和（或）AmpC酶为主。给临床抗感染治疗带来很大困难，是院内感染的一大隐患。

【关键词】  超广谱β-内酰胺酶  AmpC酶  肺炎克雷伯菌  三维试验  三维抑制试验

        AmpC酶是继ESBLs之后,临床上出现的肠杆菌科细菌的又一重要耐药机制,肺炎克雷伯菌作为条件致病菌是新生儿感染性肺炎的常见病原菌，也是重要的院内感染病原菌,在医院感染分离率一直趋于首位。近年来,由于广谱抗菌药物的广泛大量应用,导致这些细菌出现高产AmpC酶菌株。近年来，编码AmpC酶的基因已转移到质粒上，并在大肠埃希菌及肺炎克雷伯菌中出现[1]，易在不同菌种间横向播散。所以监测和检测这类细菌产ESBLs和AmpC酶的情况,对指导临床合理使用抗菌药物以及预防和控制院内感染的发生具有重要的意义。

        1  材料与方法

        1.1 　材料

        1.1.1 　菌株来源　肺炎克雷伯菌160株均分离自2008年1月至2008年12月我院新生儿病区患儿呼吸道标本。 

        1.1.2 　一次性培养皿与药敏纸片　一次性培养皿为郑州博赛产品；药敏纸片为英国OXOID公司产品。

        1.1.3   试剂  克拉维酸（中国药品生物制品检定所）；邻氯西林（上海四药有限公司）。

        1.1.4  质控菌株  E.coli ATCC25922，K.pneumoniae ATCC700603，E.cloacae 029，E.cloacae 029M。

        1.2 　方法

        1.2.1 药敏试验  按CLSI推荐的K-B纸片法进行测定，并按其制定的标准进行判读。

        1.2.2 超广谱β-内酰胺酶( ESBLs) 检测  按CLSI推荐的确证试验测定ESBLs。

        1.2.3 　产AmpC酶菌株初筛  采用K-B法，按照CLSI推荐的方法进行[2]，头孢西丁(30μg/片)抑菌环直径≤17mm时，提示对FOX中介或耐药为疑产AmpC酶菌株。

        1.2.4   β-内酰胺酶粗提取物的制备  取50μl0.5麦氏单位菌液加入12ml胰蛋白胨肉汤中，35℃恒温摇床孵育6h,4000r/min，4℃离心20min，弃上清，将沉淀物-70℃反复冻融5次，加入pH 7.0的0.01mol/L磷酸盐缓冲液1.2ml混匀，14000r/min，4℃离心20min，取上清液即为酶粗提物，无菌试验后-20℃保存。

        1.2.5 　三维试验  对可疑菌株的酶提取物用头孢西丁三维试验方法进行AmpC 酶确证。 

        1.2.6 　三维试验抑制试验[3]  在涂有E.coli ATCC25922 菌液的M-H平皿中央贴1片30μg头孢曲松纸片,垂直挖四个狭缝,分别加入40μl的试验菌株酶粗提取物、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L邻氯西林、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L克拉维酸、36μl酶粗提取物+4μl 2mmol/L克拉维酸+4μl 2mmol/L邻氯西林,35℃培养24h,扩大生长区域消失为酶抑制实验阳性。

        2  结果

        2.1  160株肺炎克雷伯菌耐药现象较为严重，对16种抗菌药物中的13种均出现不同程度的耐药，其中对青霉素类、一代至四代头孢菌素的耐药率均超过60% ，经ESBLs确证试验测定产ESBLs有84株，阳性率高达52.50%。对加酶抑制剂的β内酰胺类复合制剂舒普深、特治星的敏感率仅为55.06%、56.05%，头霉素类的头孢西丁敏感率仅为55.63%，应引起临床重视。尚未出现对碳青酶烯类耐药的肺炎克雷伯菌菌株。转

2.2 经产AmpC酶菌株初筛试验检出可疑产AmpC酶细菌71株，经头孢西丁三维试验方法确证产AmpC酶细菌5株。经三维抑制试验确证单产AmpC酶菌株5株（与三维试验相符），单产ESBLs菌株84株（与ESBLs纸片确证试验相符）。同时产Ampc+ESBLs菌株18株，即产超超广谱β内酰胺酶(SSBLs)，耐药情况非常严重，对β-内酰胺类抗菌药物（包括含酶抑制剂的复合制剂）全部耐药，氨基糖苷类、喹诺酮类耐药率也有所提高，仅碳青酶烯类未出现耐药。

        3  讨论

        超广谱β内酰胺酶（ESBLs）属于Bush分类2be亚组，分子分类中属于A类酶，ESBLs是目前肠杆菌科细菌（尤其是肺炎克雷伯菌）对广谱头孢菌素产生耐药的最主要原因，它由质粒介导，可使细菌对青霉素和一、二、三、四代头孢菌素以及单环菌素耐药，但对头霉素、碳青酶烯类及酶抑制剂（克拉维酸）敏感。

        AmpCβ内酰胺酶是由革兰氏阴性杆菌产生的主要由染色体介导的丝氨酸头孢菌素酶组成的一个酶家族，属于Bush分类中的Ⅰ组（C类），能水解三代头孢，不被β内酰胺酶抑制剂克拉维酸所抑制。研究表明:β-内酰胺类抗菌药物头孢西丁和碳青酶烯抗菌药物亚胺培南是强有力的AmpC酶诱导剂[4]。如果用头孢西丁或头孢西丁联合第三代头孢菌素治疗含有ampC基因的肠杆菌科细菌如肺炎克雷伯菌、大肠埃希菌，那么在治疗过程中会因为AmpC酶的大量产生而导致治疗失败。理论上讲，四代头孢对产AmpC酶菌株敏感，但如果同时产ESBLs则四代头孢也将无效。

        实验结果显示，我院新生儿病区分离出的160株肺炎克雷伯菌耐药情况十分严重，仅对阿米卡星、亚胺培南、美罗培南尚未出现耐药，其他16种抗菌药物均出现不同程度的耐药，其中对新生儿适用的β-内酰胺类抗菌药物耐药严重，一代至四代头孢菌素耐药率均超过60%，舒普深、特治星敏感率也仅有55.06%和56.05%。产超超广谱β内酰胺酶(SSBLs)的肺炎克雷伯菌检出率高达11.25%(18/160)，针对这类细菌临床用药唯有选用亚胺培南、美罗培南，抗菌药物可选范围之局限令人担忧。

        由于临床大量广泛使用三代头孢、亚胺培南、美罗培南，在抗菌药物的选择压力下我院新生儿科已筛选出持续高产型AmpC酶菌株，一旦处理不当，将持续在医院环境内扩散。如果进一步出现质粒介导的AmpC酶菌株[5]，则对院内感染将造成严重的威胁。因此，规范临床合理使用高级抗菌药物的任务已迫在眉睫。《抗菌药物临床应用指导原则》[6]规定，碳青酶烯类药物不宜用于治疗轻症感染，更不可作为预防用药。因此临床对怀疑细菌感染性肺炎的经验性用药或预防性用药应尽量避免碳青酶烯类的使用。

作者：吴健宁 林润华 林健《中外健康文摘》

参考资料（略）