4种黄连生物碱的抑菌作用

【摘要】  　　目的小檗碱，药根碱，黄连碱和巴马亭是黄连中4种主要的生物碱，为深入研究4种黄连生物碱成分的抑菌特性差异，本实验对它们的抑菌谱和抑菌活性进行了实验研究。方法以从石柱黄连中提取的4种生物碱为实验药物，采用抑菌圈实验法，在2 000 μg/mL药液浓度下对常见的19种微生物进行了药物敏感性试验,并通过比浊法对敏感菌的最小抑菌浓度（MIC）进行了检测。结果4种生物碱成分的敏感菌范围相同但抑菌活性不同，其中小檗碱的抑菌活性最大,黄连碱和巴马亭次之，药根碱最小；4种黄连生物碱对革兰氏阳性菌的抑制活性大于革兰氏阴性菌和酵母菌；每种生物碱对耐药金葡菌（MR）和金葡菌的抑菌能力基本相同。结论4种黄连生物碱均为黄连的抗菌活性成分，抑菌谱相同，但抑菌活性有较大差异；4种黄连生物碱对耐药金葡菌的耐药性具有消除作用。

【关键词】  黄连 小檗碱 药根碱 巴马亭 黄连碱 抑菌

　　Abstract:ObjectiveBerberine, jatrorrhizine, palmatine, and coptisine are four leading alkaloids from Coptidis rhizome. To research the characteristics of antimicrobial activity of above alkaloids, the antimicrobial spectrums and abilities of them were determined in this paper.MethodsSensitivities of 19 microorganisms to berberine, jatrorrhizine, palmatine, and coptisine were studied under medicine concentration of 2 000μg/ml by antimicrobial circle experiment and their Minimum Inhibitory Concentrations (MIC) against 14 sensitive microorganisms were determined by colorimetry in this study. ResultsFour alkaloids from Coptidis rhizome had the same antimicrobial spectrums and different antimicrobial abilities, the antimicrobial activity of berberine was the strongest, coptisine and palmatine was relatively weak and jatrorrhizine was the worst. The antimicrobial abilities of four alkaloids against G+ bacterium were stronger than against G－ bacterium and fungus. The same activity of four alkaloids against Methicitlin resistant Staphylococcus aureus (MRSA) and Staphylococcus aureus were observed.ConclusionAll alkaloids tested are antimicrobial activity ingredient of Coptidis rhizome. Four alkaloids almost have the same antimicrobial spectums and have different antimicrobial abilities. All alkaloids tested can dispose the drug resistance of Methicitlin resistant Staphylococcus aureus (MRSA).

　　Key wordsCoptidis rhizome;   Berberine;   Jatrorrhizine;   Palmatine;   Coptisine;   Antimicrobial activity

　　黄连是中医临床上的常见抗菌消炎中药，在临床上除主要用于治疗菌痢、肠炎、腹泻、胃炎等细菌性胃肠炎疾病。研究表明，黄连中的抗菌消炎的物质基础主要是其中所含的原小檗碱类生物碱成分，而小檗碱，药根碱，黄连碱和巴马亭是黄连中4种主要的生物碱成分，在分子结构特点上均属异喹啉类生物碱,具季铵基团［1］。为深入研究黄连中不同生物碱成分的抑菌活性差异和拓展黄连生物碱的应用领域，从石柱黄连中提取了小檗碱、药根碱、黄连碱和巴马亭，以常见的19种动植物病原菌为实验菌进行药物敏感性实验并对敏感菌的最小抑菌浓度（MIC）进行检测，以期为扩展小檗碱和其它黄连生物碱的应用范围和临床用药提供科学依据。

　　1  器材

　　实验药物：小檗碱、药根碱、黄连碱和巴马亭（由实验室从石柱黄连中提取分离制备，HPLC检测纯度均在97%以上）。实验菌株：金黄色葡萄球菌 (ATCC25923)，金黄色葡萄球菌耐药菌（MR），脓肿分枝杆菌，伤寒杆菌，绿脓杆菌，志贺氏痢疾杆菌，克雷伯氏菌，肠炎沙门菌，巨大芽孢杆菌，枯草杆菌，大肠杆菌变形杆菌，白色葡萄球菌，假丝酵母，白色念珠菌，四联球菌，鱼害粘球菌和鱼肠型点状产气单胞菌（实验菌株由重庆医科大学基础医学院病原微生物教研室和西南大学资源与环境科学学院微生物教研室提供）。

　　培养基：真菌采用改良沙保氏培养基（配方为：蛋白胨10 g，葡萄糖20 g，蒸馏水1 000 ml），鱼病原菌（鲑肾杆菌，鱼害粘球菌和鱼肠型点状产气单胞菌）采用胰蛋白胨醋酸钠培养基（配方：胰蛋白胨5.0 g， 醋酸钠2.0 g，酵母膏5.0 g，牛肉膏0.2 g，蒸馏水1 000 ml），其它细菌采用普通细菌培养基加减成分进行培养。配制时固体培养基加入1.5%的琼脂，液体培养基不加。

　　实验设备：96微孔板，酶标仪，超净工作台，灭菌锅，恒温培养箱。

　　2  方法

　　2.1  微生物敏感性实验将备选的菌种采用较高浓度的药液进行药物敏感实验，初步确定3种生物碱对实验菌的抑菌作用，为进一步研究药物对敏感菌的抑菌能力提供依据。

　　方法为：①药液配制及纸片制备：将每种药液均配制成浓度为2.0 mg/ml的溶液，将直径6.35 mm的纸片浸泡于药液，100℃/30  min灭菌，冷却后置冰箱保存。②菌液制备：将实验菌种先接种到斜面活化培养24 h, 脓肿分枝杆菌培养2 d后用灭菌生理盐水洗下，计数后用液体培养基配成108 cfu/ml的菌液。③抑菌圈试验：用灭菌后的涂布环将试验菌液均匀涂抹于固体琼脂平板上，每个平板放上3个药物纸片，脓肿分枝杆菌培养2 d，其它实验菌培养24 h后观察，记录抑菌环直经。

　　2.2  敏感菌的MIC定量实验对3种药液进行药物敏感性实验以后，挑选敏感的菌种，采用液体培养基连续稀释法培养后检测每种黄连生物碱对敏感菌的最小抑菌浓度（MIC）。

1∶8，1∶16，1∶32，1∶64，1∶128，1∶256，1∶512和1∶1024共11个浓度。②实验操作在96微孔板上进行，每试验微孔用移液枪加入液体培养基100 μl，试验菌液20 μl，药液120 μl，混匀后置37℃培养，脓肿分枝杆菌培养2 d，其它实验菌培养24 h后观察。每个实验3个重复并设立不加实验菌的本底对照（120 μl药液＋120 μl液体培养基）。③采用酶标仪检测微孔板实验菌的生长情况，检测指标为微孔中培养液体系的光密度（OD值），检测波长620 nm。实验微孔的OD值减去同浓度的本底对照的OD值即为实验微孔的OD净值。根据OD净值判定药物对该实验菌的MIC。

　　3  结果与讨论

　　3.1  药物敏感性实验表1为黄连中4种生物碱对常见19种微生物药物敏感性试验的观察结果，从表中可以看出，4种黄连生物碱的敏感菌菌谱除了药根碱以外其它3种基本相同，从表中数据不难发现，黄连生物碱类对G+菌比对G－菌和真菌的作用更加明显。表1  黄连生物碱对19种病原菌的药敏实验 （略）

　　3.2  黄连生物碱敏感菌的MIC测定表2为4种黄连生物碱在2 000 μg/ml浓度纸片法条件下筛选出的14种敏感菌的MIC测定结果，从表中数据可知：4种生物碱对同种敏感菌的抑菌能力有一定的差异，总体分析来看，小檗碱的抑菌作用和抑菌谱似乎更大一些，黄连碱和巴马亭次之，药根碱最弱。由于药物的难溶性而限制进一步提高药物浓度，在表面看来是抑菌谱的差异实际上可能是抑菌能力的差异。同时在试验中还观察到4种生物碱对耐药金黄色葡萄球菌有较强的抑制作用，小檗碱，黄连碱和巴马亭对脓肿分枝杆菌具有一定的抑制作用。表2  4种黄连生物碱对敏感菌的MICμg·ml-1（略）

　　小檗碱，黄连碱，巴马亭和药根碱是黄连中含量最为丰富的4种生物碱，4种生物碱具有相同的基本分子骨架即原小檗碱类生物碱分子骨架和芳型季铵氮结构，4种生物碱均具有相同的异喹啉基本分子骨架，抑菌谱理论上不会产生较大差异。而Iwasa等［2］报道原小檗碱类生物碱的药效必需结构为7位的芳环季铵氮结构，4种生物碱在分子结构上的区别在于A环2，3位取代基团和D环9，10位的取代基团的不同，而在A环和D环取代基团不同对原小檗碱类化合物的抑菌活性会有增减作用。

   

　　张传美等［3］发现黄连复方三黄汤或黄连小檗碱对庆大霉素大肠杆菌具有很好的抑制活性，认为它们能抑制和消除耐药菌株的抗药性。本实验中4种黄连生物碱对金葡菌和耐药金葡菌（MR）的MIC基本相同，进一步证明了黄连生物碱对耐药菌株有较好的抑制作用，就此现象进行研究具有很高的医学价值。

对原小檗碱类化合物药理作用的深入研究后发现，该类化合物除了具有较强的抗菌消炎作用外，而且还具有降血脂，降血糖，抗肿瘤和抗疟疾等药理作用［3～5］。因此，对原小檗碱类生物碱药物化学的深入研究具有较高的科研价值。

作者：杨勇 叶小利 李学  《时珍国医国药》

  　　［1］Ji Y B. The pharmacology and application of the active component of chinese herbs［M］. Harbin: Heilongjiang technological press , 1995：691.

　　［2］K Iwasa, M Kamigauchi, M Ueki, et al. Antibacterial activity and structure-activity relationships of berberine analogs［J］. Eur J Med Chem , 1996, 31: 469.

　　［3］Zhang C M, Liu N B ,Yu M, et al. Inhibition of Compounding of Gentamycin , Sanhuangtang and Berberine to E. coli in Vitro［J］.J Laiyang Agri Co, 2004，21 (1) : 14.

　　［4］Wei J, Jiang J D, Wu J D, et al. Research on the effective improvement of hyperlipidemia by berberine［J］.Chin J Diabetes, 2005 , 13(1): 49.

 

［5］Yin J, Hu R M, Tang J F, et al. Glucose-lowering effect of berberine in vitro［J］.Acta Univ Med Second Shanghai, 2001, 21(5) : 4252.