千里光水浸液对大肠埃希菌R质粒的消除作用

【摘要】  　　目的探讨千里光对大肠埃希菌R质粒消除作用。方法对尿路感染患者尿液中分离的大肠埃希菌R质粒进行检测，并选用中药千里光水浸液对该质粒进行了体外、体内消除实验。体外实验：千里光水浸液亚抑菌浓度分别作用大肠埃希菌24，48，72 h后，影印培养，计数消除子数；体内实验：建立肠道去污染小鼠动物模型后，经口感染大肠埃希菌，同时给千里光水浸液，灌胃给药，每只2 mg/d，分别于给药后24 ，48，72 h后处死小鼠，分离培养细菌，计数消除子数。消除子经质粒抽提琼脂糖凝胶电泳鉴定。结果体外药物作用24，48，72 h后，R质较消除率分别为：0.2%，2.2%，3.8 %；SDS对照组分别为12.1%，14.9%，23.7%，体内药物作用24，48，72 h R质粒消除率分别为0%，3.1%，14.4%，对照组分别为0%，0.1 %，0.1%。结论中药千里光水浸液对大肠埃希菌R质粒于体内、体外均具有消除作用，体内消除作用强于体外。

【关键词】  千里光 大肠埃希菌 R质粒消除

　　Abstract:ObjectiveTo explore the elimination effect of Senecio scandens Buch-Ham (SSB) Liquid Extracts on R plasmid (RP) of Escherichia coil．MethodsRP of E.coil were isolated from the urine of urinary tract infection patients, and the elimination test of SSB extracts on these plasmids was performed in vitro and in vivo. After sub-bacteriostatic concentration of SSB extracts treated E.coil in vitro for 24 h, 48h and 72h. Replica plating and counting of colonies resisting to antibiotics were carried out. Germ-free mice in intestine were orally inoculated with E.coil, then water decoct agent of SSB was given orally in 2 mg/d per mouse, Eliminant of E.coil was identified by replica plating and colony counting after 24 h, 48h and 72 h, respectively．RP eliminated bodies were identified through electrophoresis with agarose gel. ResultsAfter drug acted on E.coil 24 h, 48h and 72h in vitro respectively, elimination rate of RP in SSB tested group were 0.2%, 2.2%, 3.8%, while in control SDS group were 12.1%, 14.9%, 23.7%，respectively; 24 h, 48h, 72h in vivo, elimination rate of RP in test group were 0, 3.1%, 14.4%, and in control group were 0, 0.1%, 0.1%, respectively.　ConclusionSSB has strong function to eliminate RP of E.coil in vivo and in vitro. The eliminative effect is stronger in vivo than in vitro.

　　Key words:Senecio scandens Buch-Ham;   Escherichia coil;   R plasmids;   Elimination

　　大肠埃希菌作为条件致病菌是医院内感染最常见病原菌之一，其耐药菌株引起的感染日益增多。细菌的耐药性由染色体或耐药质粒(R质粒)介导，耐药质粒可通过接合、转化、转导等方式在不同菌种之间传递，使敏感菌成为耐药株，造成了R质粒的流行［1］。影响R质粒传播的因素主要是由于抗生素的滥用，即抗生素的使用起到了选择作用，使含有R质粒的菌株得以生存、扩增。将R质粒从宿主菌中消除，使其恢复对抗生素的敏感性，是临床治疗多重耐药菌感染的新思路［2］。用人工方法消除R质粒国内外曾有报道［3］。本实验用中药千里光水浸液作为消除剂，对大肠埃希菌R质粒进行体内、体外消除实验，观察千里光对耐药质粒的消除作用，探讨其临床应用的可能性。

　　1  材料

　　1.1  菌株　

　　大肠埃希菌(E.coil)，从赣南医学院第一附属医院尿路感染患者尿中分离并鉴定为大肠埃希菌。

　　1.2  药品与试剂　

　　千里光购于江西赣南医学院附属医院中药房，取干燥生药50 g，加适量水煮沸30 min，过滤，药渣再加水煮沸30 min，过滤，合并两次滤液，浓缩到50 ml，即得1 g/ml千里光水浸液。营养琼脂为上海医学化验所产品；LB肉汤培养基(每毫升中含蛋白胨1 g，酵母抽提物5 g，氯化钠5 g，葡萄糖1 g，pH7.2)；十二烷基硫酸钠(SDS)购于华美生物工程公司；四环素（TC）、氨苄青霉素(AP)、链霉素(SM)均系国产标准品。

　　1.3  动物　

　　昆明小鼠30只，6～8周龄，体重18～20g，雌雄不限，由赣南医学院实验动物部提供。

　　2  方法

　　2.1  实验菌耐药性测定　

　　以平板稀释法［4］测定各抗生素对大肠埃希菌的最小抑菌浓度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。

　　2.2  体外消除实验　

　　按文献［5］方法进行。将大肠埃希菌接种于 LB肉汤培养基中，37℃过夜振荡培养，调菌液浓度1.5×109cfu/ml。取菌液5 μl分别加入含不同浓度千里光(自100 mg/ml开始，倍比稀释至第7管，第8管不加药为空白对照管)的LB肉汤培养基中，每管LB培养基总量为1 ml。37℃振荡培养24，48，72 h后取出，观察细菌生长现象，判定亚抑菌浓度。从亚抑菌浓度管中取50 μl菌液分别划线接种于10块4%琼脂平板培养基上，37℃培养24 h，待长出单个菌落后，挑取单个菌落1 000个，以影印培养法，依次转接于含TC(20μg/ml)，SM(40 μg/ml)或AP(20 μg/ml)的药物平板上以及不含药物的4%营养琼脂平板培养基上，37℃培养24 h，观察并记录结果。挑取在无药平板上生长而在含药物平板不长的菌落，即初步确定为R质粒消除子，再经相同抗菌药物平板复试以后，最后确定为R质粒消除子。将搜集到的消除子与原菌液同时按文献［6］快速抽提质粒DNA，0.7%琼脂糖凝胶电泳，以检测质粒带的消失情况。另设SDS阳性对照组和空白对照组，消除实验方法同上。

　　2.3  体内消除实验 

　　2.3.1  建立大肠埃希菌肠道感染的小鼠模型［7］将实验用小鼠均置消毒过的塑料笼内于无菌箱内饲养。第1天，每只小鼠经灌胃法给四环素5 mg，红霉素1 mg，8 h后给利福平6 mg。另外，饲以经高压灭菌的饮料块和含四环素(0.5 mg/ml)，红霉素(0.01 mg/ml)的无菌饮水。第2～3天每只小鼠给利福平6 mg，第4～5天每只小鼠给四环素2 mg，用大肠埃希菌 (菌液浓度1.5×109 cfu/ml) 0.2 ml/只经口感染，饮水和饮料同前。

2.3.2  大肠埃希菌R质粒的消除从第6天起将模型小鼠隔离，并随机分6组，即3个实验组及相应对照组，每组5只。实验组灌胃给予千里光水浸液(每只2 mg/d)，对照组不给任何药物。同时，所有小鼠均禁食，但给经煮沸消毒的含蔗糖(10%)、氯化钠(0.8%)、碳酸氢钠(0.10%)的饮水。给药后分别于24，48，72 h后处死小鼠，取盲肠内容物接种在4%营养琼脂平板培养基上，37℃培养24 h，分离单个菌落，每组随机挑取1 000个菌落影印培养，计数消除子数，再经质粒抽提，琼脂糖凝胶电泳鉴定，步骤同上。

　　2.4  统计学分析

　　各组实验数据釆用SPSS 10.0统计软件处理，进行采用χ2 检验。

　　3  结果

　　3.1  大肠埃希菌对抗生素耐药性检测结果 

　　TC，SM，AP对大肠埃希菌MIC均>800 μg/ml，呈高度耐药，千里光对大肠埃希菌MIC为12.5 mg/ml。

　　3.2  体外消除实验

　　千里光体外作用大肠埃希菌24 h后，其消除结果与空白对照组比较，无明显差异(P>0.05)；体外作用48 h与72 h后，其消除结果与空白对照组比较，有极显著性差异(P<0.01)，表明千里光体外有消除大肠埃希菌R质粒作用，但其消除作用低于SDS对照组(P<0.01) 。结果见表1。表1  千里光水浸液作用不同时间后对大肠埃希菌R质粒体外消除的影响（略）

　　3.3  体内消除实验 

　　千里光体内作用大肠埃希菌24h，其消除结果与对照组经卡方检验P>0.05，无显著性差异； 48 h与72 h消除结果经卡方检验P<0.01，有极显著性差异，表明千里光体内对大肠埃希菌R质粒也有消除作用。结果见表2。表2  千里光水浸液作用不同时间后对大肠埃希菌R质粒体内消除的影响（略）

　　3.4  消除R质粒的表型千里光在小鼠体内R质粒的消除实验中，试验菌株的耐药性可表现为单一或多重(二耐以上)耐药性的丢失，而体外消除实验和对照组R质粒的丢失表现为单一耐药性的丢失。

　　3.5  消除子的质粒检测结果　

　　原始株与消除子经碱裂解法快速抽提质粒DNA，琼脂糖凝胶电泳观察发现消除子均都丢失1至数条质粒带，表明在千里光作用下，质粒被消除。

　　4  讨论

　　质粒编码所产生的细菌耐药性和毒力等问题，给人类疾病治疗带来了很大困难，肠道耐药基因库的存在是肠道致病性耐药菌株流行的潜在危险。消除耐药质粒，使耐药菌株恢复敏感性，对于治疗临床上由耐药菌导致的感染和阻断耐药性和毒力的传播都有非常重要的意义。

　　质粒具有自然丢失与人工消除的特性，但R质粒自发消除很缓慢，其消除频率为10-2～10-8［8］。自20世纪60年代以来，人们发现各种理化因素均可消除R质粒，如高温培养、紫外线照射、电穿孔法、SDS、高温SDS双重处理、嗅化乙锭、丫啶橙等可影响R质粒消除，抗生素也具有R质粒消除作用［3］。R质粒消除后细菌的耐药性也随之丧失，R质粒与染色体突变不同，R质粒消除后其耐药性不再恢复，除非外源R质粒再次转入，但由于这些物理化学因素对人体均有较强的毒副作用，不便投入临床应用［3］。中药属于天然植物药，毒副作用小，应用安全。中药的质粒消除研究始于20世纪80年代，1983年徐建国等报道用黄连素消除去污染小鼠体内痢疾杆菌的R因子；1985年陈小英［2］报道用大黄素消除金黄色葡萄球菌的耐药质粒，此后陆续有相关研究报道，但多为抗菌能力强的清热解毒或清热燥湿类中药。本实验选用的千里光为对大肠埃希菌具有较强抑制作用的清热解毒类中药，MIC为12.5 mg/ml，故选其作为消除剂。结果表明：千里光对大肠埃希菌R质粒具有消除作用，且体内消除作用强于体外，其可能原因是在体内细菌不仅受到药物的作用，同时受到机体的内环境，特别是免疫因素影响。R质粒的消除不仅表现为单一耐药性的丢失，还表现为多重耐药性的丢失；消除R质粒最佳时间为体外48 h(P<0.01)，体内72 h (P<0.01)。

中药千里光在临床上不但可用于体外，也可用于体内，其抗菌能力的强弱与其对细菌质粒消除率的大小之间是否存在相关性还不清楚，因此有关千里光水浸液对R质粒的消除机制有待进一步研究。

   作者：张文平 曹镐禄 张文书 黄真 《时珍国医国药》

【参考文献】

  　　［1］Mandic A, Ostojic N. The role and importance of plasmid resistance in certain pathogenic enterobacteria ［J］.Med Pregl,1995,48(12)：437.

　　［2］李苌清, 周岐新, 凌保东. 耐药质粒消除的研究概况与展望［J］. 川北医学院学报, 2003,18(2): 168.

　　［3］陈军剑, 陈 群. 中药对R质粒消除作用的研究［J］.中国微生态学杂志, 2003, 15(2)：120.

　　［4］George M，Eliopoulos，Robert C，et a1．Antimicrobial Combinations［M］.Antibootics in Laboratory Medicine,4th ed,1996：330．

　　［5］陈 群, 陈菊南,王胜春.黄连对大肠杆菌R质粒消除作用的实验研究［J］.中国中西医结合杂志, 1996,16(1):37.

　　［6］金冬燕, 黎盂枫. 分子克隆实验指南，第2版［M］. 北京：科学出版社，1992：19.

　　［7］刘 克, 关 键, 李菁华, 等. 黄芩甙对铜绿假单胞菌R质粒的消除作用［J］.微生物学杂志, 2003,23(2)：49.

［8］陆德源 .医学微生物学，第4版［M］. 北京：人民卫生出版社, 1996：50.

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