石莲子的体外抑菌活性研究

【摘要】  　　目的通过初步筛选发现石莲子提取具有较好的抑菌活性，探讨石莲子不同溶剂提取物的抑菌作用。方法制备石莲子不同溶剂提取物，采用打孔琼脂扩散法和稀释法对石莲子不同溶剂提取物进行抑菌实验研究。结果实验数据表明石莲子的不同溶剂提取物对供试的细菌和部分真菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌、粪链球菌以及黄霉菌）均有一定程度的抑制效果，且不同溶剂提取物对各种供试菌的抑菌活性不同。结论石莲子的不同溶剂提取物对部分细菌和真菌有一定程度的抑制效果，这将为进一步全面开发石莲子提供基础。

【关键词】  石莲子 抑菌 最小抑菌浓度 抑菌圈

　

　　Abstract:ObjectiveThis research intended to study the antibacterial activities of different solvents extracts of nelumbo nucifera Gaertn.MethodsVarious extracts were prepared from Nelumbo nucifera Gaertn,and the the minimal inhibitory concentration(MIC) and inhibitory circle of the extract were determined.ResultsThe results showed that the antibacterial activity of the extracts was different toward different microbes.ConclusionThe experimental date demonstrated that extracts of nelumbo nucifera Gaertn exhibited strong antibacterial activities. This research is benefit for further study and use of the Nelumbo nucifera Gaertn.

　　Key words:Nelumbo nucifera Gaertn;   Antibacterial;   MIC；  Inhibitory circle

　　石莲子又称为甜石莲、莲实、壳莲子、带皮莲子, 来源于睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn的成熟果实，英文名为NELUMBINIS LB［1］。本品为椭圆形，两端略尖，长1.8 cm左右，直径约1.2 cm。外壳灰黑色，表面平滑，一端有小圆凹点，另一端有微小短柄，壳厚约1 mm内含莲子1枚。质坚硬，不易破裂［2］。石莲子具有补益脾胃、祛热毒、清心除烦的功效，可用于缓解和治疗冷热呕吐、食物不下、淋浊等症状［3］。据报道，从石莲子中提取的莲心碱具有降压、抗心率失常等作用［4］，而石莲子在抑菌方面的研究却未见报道。本研究在初步筛选中发现石莲子具有较好的抑菌活性，为充分发掘石莲子的市场潜力，开发其可利用性，本文对石莲子不同溶剂浸提得到的各提取物对常见致病革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌及黄霉菌的体外抑菌活性进行了研究，为阐明其抗菌特性以及进一步开发这一新资源提供参考。

　　1  器材与方法

　　1.1  材料与仪器

　　1.1.1  材料石莲子购于贵州省药材公司，产地：广西，包装批号060702。

　　1.1.2  试剂石油醚，醋酸乙酯，甲醇，乙醇，95%乙醇，二甲基甲酰胺，均为分析纯, 购于贵阳中兴化学试剂公司。

　　1.1.3  菌种购自中国微生物菌种保藏中心，金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus；大肠杆菌Escherichia coli；粪链球菌Enterococcus faecalis；黄霉菌Aspergillus flavus；绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa；藤黄微球菌Micrococcus luteus。

　　1.1.4  培养基MRS固体培养基：酪蛋白胨10   g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2.0 g，Tween80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，MnSO4·H2O 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCO3 20.0g，琼脂15 g， 定容至1 000 ml，pH值 调至6.8；营养肉汤固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，定容至1 000 ml，pH值 调至7.0；查氏固体培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1.0 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，液体培养基组成除了不加琼脂外，与相应的固体培养基相同。

　　1.1.5  仪器高低温恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），旋转蒸发仪（BUCHI R-200），SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），电子天平（OHAUS）净化工作台（上海市纯昱科学仪器有限公司），真空冷冻干燥机（LABCONCO），超低温冰箱（Forma Scientific），双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司TU-1901）。

　　1.2   方法

　　1.2.1  石莲子不同溶剂提取物的制备将干燥的石莲子粉碎过40目筛，称取等量的石莲子3份，每份150 g，分别置于1 000 ml的水、酒精、醋酸乙酯中。每种溶剂浸泡3次，每次置于恒温（37℃）揺床上（200 r/min）振荡12 h，抽滤得到提取液。水的提取液于-80℃冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；酒精提取液40℃减压旋转浓缩除去酒精，于-80℃冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；醋酸乙酯提取液先减压浓缩除去醋酸乙酯，得浸膏。

　　1.2.2  对各部分粗提物的抑菌活性检测菌种培养：金黄色葡萄球菌（staphylococcus aureus），大肠杆菌（Escherichia coli），绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa），藤黄微球菌（Micrococcus luteus）采用营养肉汤培养基（组成成分见上）活化培养，粪链球菌（Enterococcus faecalis）采用MRS培养基（组成成分见上）活化培养，黄曲霉（Aspergillus flavus）采用查氏培养基（组成成分见上）活化培养，分别将各菌种浓度调至OD600约为1，待用。

采用试管稀释法对最低抑菌浓度（MIC）的测定：取上述得到的水和酒精溶剂的粗提物0.1 g, 溶于1 ml无菌水中，醋酸乙酯溶剂的提取物0.1 g溶于1 mlDMF，使其充分溶解，用细菌过滤器过滤，取0.3 ml样品溶液以相应的液体培养基倍比稀释成样品浓度分别为50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.57, 0.79 mg/ml，分别在试管中加入30 μl菌液，置于37℃恒温培养16 h。分别取100 μl菌悬液均匀涂板。然后放37℃温箱静止培养24 h后取出， 每梯度涂布3个平板，整个过程重复两次，测定最小抑菌浓度（MIC），筛选出抑菌活性最强的组分［5］。

　　抑菌圈的测定方法：取各溶剂的浸提物30 mg，分别用相应的溶剂（无菌水，乙醇，醋酸乙酯）1 ml，制成30 mg/ml样品溶液，用细菌过滤器过滤。在相应的固体培养基平板上加0.1 ml菌液，均匀涂布。稍干后用8 mm打孔器打孔，每孔加0.1 ml样品，37℃培养24 h，测量抑菌圈大小。

　　2  结果

　　2.1  石莲子不同溶剂提取物MIC比较抑菌实验结果见表1。采用试管稀释法对石莲子3种溶剂提取物的最低抑菌浓度的进行测定，结果表明石莲子的3种溶剂提取物对供试菌具有不同的抑制作用：表1  石莲子不同溶剂提取物各组分的最低抑菌浓度（略）

　　水溶剂浸提物对藤黄微球菌有很明显的抑制作用，最低抑菌浓度为6.25 mg/ml；对金黄色葡萄球菌、黄曲霉的抑制效果较好，最低抑菌浓度均为12.5 mg/ml；对大肠杆菌、绿脓杆菌的抑制效果稍差，最低抑菌浓度为25 mg/ml；对粪链球菌的最低抑菌浓度为50 mg/ml。

　　乙醇溶剂浸提物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌的抑制作用较好，最低抑菌浓度均为12.5 mg/ml；对其它的供试菌的抑制效果稍差，对粪链球菌和黄曲霉的最低抑菌浓度为25 mg/ml。

　　醋酸乙酯溶剂浸提物对黄曲霉抑菌活性显著，最低抑菌浓度为6.25mg/ml；对其它的供试菌的抑制效果稍弱，对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的最低抑菌浓度均为25 mg/ml；对大肠杆菌、藤黄微球菌和粪链球菌的最低抑菌浓度为50 mg/ml。

　　从各种供试菌对石莲子浸提物的敏感性上来看，不同菌种对不同溶剂提取物的敏感性不同：黄曲霉对石莲子醋酸乙酯提取物很敏感，最低抑菌浓度为6.25 mg/ml；绿脓杆菌对石莲子的酒精的提取物较为敏感，最低抑菌浓度为12.5 mg/ml；金黄色葡萄球菌对石莲子的水和酒精的提取物均较为敏感，最低抑菌浓度为12.5 mg/ml；大肠杆菌对石莲子的酒精提取物较为敏感，最低抑菌浓度为12.5 mg/ml；藤黄微球菌对石莲子的水提取物很敏感，最低抑菌浓度为6.25 mg/ml；粪链球菌对石莲子的酒精提取物较为敏感，最低抑菌浓度为25 mg/ml。

　　2.2  不同溶剂提取物的抑菌圈结果抑菌实验结果见表2。石莲子不同溶剂提取物对各种供试菌的抑菌活性不同。石莲子醋酸乙酯溶剂的提取物对金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、藤黄微球菌和黄霉菌的抑制效果较强，抑菌圈直径均大于10 mm；石莲子水浸提物对金黄色葡萄球菌，藤黄微球菌和黄霉菌的抑制效果较强，抑菌圈直径均大于10 mm；石莲子乙醇浸提物对大肠杆菌的抑制效果较强，抑菌圈直径等于10 mm。表2  石莲子不同溶剂提取物抑菌圈直径（略）

　　3  讨论

　　近年来，有关石莲子和其中的有效成分莲心碱的研究很多，涉及到各个方面［6］，但石莲子具有抗菌作用却一直未见报道。本研究对石莲子的水、乙醇以及醋酸乙酯提取物的抑菌作用进行了研究，为全面开发石莲子的药用价值提供研究基础。

本研究采用体外微生物敏感实验测定方法，评价和比较了石莲子不同溶剂提取物的体外抑菌效果，实验结果表明石莲子不同溶剂提取物均有明显的体外抑菌作用，且不同溶剂提取物对各种供试菌的抑菌活性不同，这很可能意味着有不同的化合物具有抑菌作用，下一步的研究工作我们将对其进行活性指导下的活性化合物的进一步分离纯化。

作者：周英，段震，李纯纯，黄赤夫《时珍国医国药》

  　　［1］Cui Shude, Traditional Chinese medicine collected works［M］, Hei Longjiang science and technology publishing company in Ha Erbin,637.

　　［2］李雅文，郝金德.石莲子与苦石莲应区别药用［J］.时珍国医国药,2004,15(4):229.　　

　　［3］蒲有能，卫爱黎.石莲子的民间用法及成分初探［J］.中国民族民间医药杂志,1998,2：20.

　　［4］Ling ZQ, Xie BJ, Yang EL. Isolation, characterization, and determination of antioxidative activity of oligomeric procyanidins from the seedpod of Nelumbo nucifera Gaertn［J］. J Agric Food Chem. 2005，53(7)：2441.

　　［5］Ping Shen, Fan Xiurong,.Microbiology experiment(the third edition)［M］.Advanced education publishing company of Beijing,1996：2.

［6］许磊，姚崇舜，陈济民.莲心碱的研究概况［J］.中草药,2000,12：956.