白花蛇舌草抑菌作用研究

【摘要】  　　目的考察白花蛇舌草提取物对G+和G-的抑菌效果。方法采用打孔法和滴注法测定了白花蛇舌草95%乙醇提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、镰刀菌的抑菌作用。结果20%白花蛇舌草提取物对绿脓杆菌的抑菌环直径为（18.86±0.56） mm，大肠杆菌的为（12.78±0.44） mm；对4种供试菌的最低抑菌浓度（MIC）分别为2.0%,0.5%,0.25%,0.05%。结论白花蛇舌草提取物对革兰氏阴性菌的抑菌作用较革兰氏阳性菌明显。

【关键词】  白花蛇舌草 提取物 抑菌作用

　　Abstract:ObjectiveTo study the antimicrobial effects of extracts from Oldenlandia diffusa Willd. Methods Boring incubation and dropping incubation were used to determine the antimicrobial activities of the extract from Oldenlanida diffusa willd by 95% ethanol. Tested microbial species were Escherichia coli,  Staphalococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, and Fusariumsp respectively. Results The radius of inhibition cycle of Pseudomonas aeruginosa and Escherichia coli were (18.68±0.56) mm and (12.78±0.44) mm respectively, when the concentration of the extract was at 20%. The minimum inhibitory concentrations (MIC) of the extract were shown as following:Escherichia coli, 2.0%; Staphalococcus aureus， 0.5%; Pseudomonas aeruginosa, 0.25%; Fusarium sp., 0.05%. Conclusion The extract from Oldenlandia diffusa Willd has stronger inhibitive effects on Gram-negative bacteria than Gram-positive bacteria.

　　Key words：Oldenlandia diffusa Willd;  Extracts;  Antimicrobial effect;

　　白花蛇舌草Oldenlandia diffusa Willd为茜草科耳草属植物，别名蛇舌草、蛇针草、二叶律、白花十字草、龙舌草、鹤舌草等。其性甘寒、微苦，以全草供药用，具有清热解毒、活血化淤、利水渗湿、消肿止痛之功效［1］，有研究报道白花蛇舌草有抗肿瘤作用和免疫学活性［2,3］，故临床应用广泛，主治恶性肿瘤、胃肠炎、阑尾炎、扁桃体炎、肺炎、泌尿系感染等病症。外用治疗毒蛇咬伤、痈肿疮疖等症。笔者从白花蛇舌草中提取抑菌物质，用几种常见的微生物进行抑菌作用研究，以期为白花蛇舌草的开发利用找到新的途径。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  白花蛇舌草购自药材市场。

　　1.1.2  供试菌种金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）、绿脓杆菌（Pseudomonas aeruginosa）和大肠杆菌 (Escherichia coli)由昆明理工大学生物工程实验室保存。镰刀菌（Fusarium sp.）由云南大学提供。

　　1.1.3  培养基大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌为LB培养基，镰刀菌为马铃薯培养基。

　　1.2  方法

　　1.2.1  白花蛇舌草提取物的制备取经干燥粉碎的白花蛇舌草50 g用索式抽提器抽提，水浴加热，温度控制在90℃，用95%的乙醇回流提取36h，将抽提物蒸干，用醋酸乙酯（打孔法用）和二甲基亚砜（滴注法用）溶解， 4℃冰箱保存备用。

　　1.2.2  样品溶液的制备用醋酸乙酯溶解物分别稀释成20 ％，2％，0.2 ％，0.02 ％，0.002 ％浓度，用二甲基亚砜溶解物分别稀释成4 ％，2 ％，1 ％，0.5 ％，0.25 ％，0.125％，0.1 ％，0.05 ％，0.025 ％浓度备用。

　　1.2.3  供试菌株悬浮液的制备［4］在超净工作台上进行无菌操作。增菌培养后，用生理盐水将菌悬液稀释成含菌量(集落形成单位，cfu)：细菌为1.0×108，真菌为1.0×106。

　　1.2.4  抑菌效果测定方法采用打孔法［5］，在直径为9 cm的平板上倾倒培养基，厚度约6 mm，待冷却后每个平板加菌液100 μl，涂布均匀后用无菌钢管打3个孔，每孔直径为4  mm，在每个孔中先加0.7%琼溶液10 μl封底，再加稀释好的药物溶液40 μl，对照孔分别加入含相应浓度的醋酸乙酯无菌水溶液，然后置于37℃培养箱中培养，真菌培养48 h，细菌培养24 h。测量抑菌环直径，取平均值。

　　1.2.5  最低抑菌浓度(MIC) 和最低杀菌浓度(MBC)的测定采用滴注法［6］，将不同浓度的二甲基亚砜样品溶解液4 ml与36 ml 培养基的在三角瓶中混匀，使培养基中药物浓度为原来的10-1，倒平板，待凝固后，吸取菌液10 μl滴种在培养基上，每个平板滴8滴，二甲基亚砜作空白。实验重复3次。待菌液吸收后，平皿平放培养箱中，37℃培养，连续4 d观察菌落生长情况。对于细菌，以培养24 h不长菌的浓度为最低抑菌浓度(MIC)，4 d不长菌的浓度为最低杀菌浓度(MBC)；对于真菌，以培养2 d不长菌的浓度为最低抑菌浓度(MIC)，4 d不长菌的浓度为最低杀菌浓度(MBC)。

　　1.3  统计分析抑菌圈结果以±s记录，用student-t检验两组数据之间的显著性差异，当P＜0.05时，认为存在显著性差异；当P＜0.01时，认为存在极显著性差异。

2  结果与讨论

　　2.1  白花蛇舌草乙醇提取物的抑菌效果将白花蛇舌草的乙醇提取物用醋酸乙酯溶解，并稀释成20 ％，2 ％，0.2 ％，0.02 ％，0.002 ％的浓度，分别加入已涂各菌液平皿的孔中，每一浓度做8个孔，培养后测定抑菌圈直径。结果见表1。表1  不同浓度白花蛇舌草乙醇提取物的抑菌效果（略）

　　从表1中可以看出，随着白花蛇舌草提取物浓度的增加，其对4种供试菌的抑菌效果越明显，尤其对绿脓杆菌的抑菌效果较好，大肠杆菌次之，对金黄色葡萄球菌和镰刀菌的抑菌效果较差，在白花蛇舌草提取物浓度≤0.2%时，其对金黄色葡萄球菌和镰刀菌的抑菌效果差异不显著，基本不存在抑菌作用。

　　2.2  MIC和MBC的测定用滴注法测定了白花蛇舌草提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌、镰刀菌4种供试菌的MIC和MBC。结果见表2。表2  白花蛇舌草提取物对4种供试菌的MIC及MBC（略）

　　绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的细胞壁外，有一层主要由蛋白质组成的外膜，外膜蛋白可分为结构蛋白、转运蛋白和微孔蛋白等，它们具有不同的功能，有的转运营养成分、无机盐等进入菌体，有些药物和物质可以通过微孔蛋白形成的孔道进入菌体，但一些大分子物质则不能通过外膜进入菌体，某些大分子的药物也不能通过外膜进入菌体，这是抗绿脓杆菌药物较少的原因之一。因此，寻找抑制绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌外膜合成的药物，可使一些原来不能透过绿脓杆菌外膜的药物进入菌体，抑制菌体的生长繁殖，也可寻找既能抑制外膜合成，又有抗菌作用的药物［7］。从表2看出，白花蛇舌草提取物对供试菌绿脓杆菌的MIC为0.25%，MBC为0.5%，表明其为具有抗菌作用的药物，是否为抑制外膜合成的药物，机制尚不清楚，也有可能是黄酮类化合物的存在显示其抑菌活性［8］。据文献报道，白花蛇舌草的醇提物中含有熊果酸，对多种肿瘤细胞均有明显的细胞毒性［9］。

3  结论［10～12］    

　　白花蛇舌草95%乙醇提取物对各种供试菌的抑制效力不同，对绿脓杆菌的抑菌效果较好，37℃培养箱培养24 h后，20%的提取物醋酸乙酯溶解液的抑菌环直径为（18.68±0.56）mm，大肠杆菌的为（12.78±0.44）mm，其对这两种供试菌的MIC和MBC值也表明白花蛇舌草抗革兰氏阴性杆菌的医用前景。有关提取物中主要活性成分的结构及抑菌机理还有待进一步研究。

作者：李涛，余旭亚，韩本勇《时珍国医国药》

【参考文献】

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　　［2］单保恩，张金艳，杜肖娜，等.白花蛇舌草的免疫学调节活性和抗肿瘤活性［J］.中国西医结合杂志,2001,21(5):370，374.

　　［3］陈庆全，洪嘉玲.实用临床草药［M］.广州：暨南大学出版社，1991：87，

　　［4］俞树荣.微生物学和微生物学检验（第2版）［M］.北京：人民卫生出版杜，1997：458.

　　［5］周南进，谢 勇，李弼明，等.壳聚糖抗幽门螺杆菌的实验研究［J］.中国生化药物杂志，2003，24（2）：72.

　　［6］刘碧源，高仕瑛，李邦良，等.壳寡糖抗菌活性的实验研究［J］.中国生化药物杂志，2003，24（2）：74.

　　［7］吴剑波.微生物制药［M］.北京：化学工业出版社，2002：31.

　　［8］张海娟，陈业高，黄 荣.白花蛇舌草黄酮成分的研究［J］.中药材，2005，28（5）：385.

　　［9］Kim SH,Ahn BZ,Ryu SY.Antitum or effects of ursolic acid isolated from Oldenlandia diffusa［J］.Phytother Res,1998,12(8):553.

　　［10］范秀容，李广武，沈 萍.微生物学实验，第2版［M］.北京:高等教育出版社，1991：260.

　　［11］周邦靖.常用中药的抗菌作用及其测定方法［M］.重庆：科技文献出版社重庆分社，1987：158.

［12］余旭亚，李 涛，汪帅，等.南蛇勒提取物抑菌作用研究［J］.昆明理工大学学报（理工版）2006，3：69.

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