紫草不同提取物抗炎及抑菌作用实验研究

【摘要】  　　目的探讨紫草不同浓度的醇提物和水提物体内抗炎作用和体外抑菌作用。方法采用Kirby-Baue纸片扩散法，测定紫草不同浓度的醇提物及水提物对金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、白色念珠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、福氏Ⅱ型杆菌的抑制效果。采用二甲苯致小鼠耳部肿胀法，测定紫草不同浓度的醇提物和水提物的抗炎作用。结果①与阳性对照比较：在各种不同提取物中，80%的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、福氏Ⅱ型杆菌、无乳链球菌的抑制作用达到最强，抑菌圈直径分别为(11.17±1.26)、(10.33±1.54）和（18.67±2.08）mm，其中对无乳链球菌的抑制作用接近阳性对照药红霉素［红霉素的抑菌圈直径为（19.67±1.52）mm］；50%乙醇提取物和20%乙醇提取物的抑菌作用相对较弱。水提物对白色念珠球菌有较好的抑制作用，抑菌直径为（7.83±0.29）mm；各种提取物对大肠杆菌均无抑制作用。②紫草提取物的抗炎作用与浓度呈正相关；紫草醇提物ZCE-I（含生药0.06g/ml）、ZCE-II（含生药0.03g/ml）的抑制率分别为68.91%（P<0.01）和15.87%（P<0.05），而紫草水提物ZCW-I（含生药0.15g/ml）和ZCW-II（含生药0.06g/ml），是醇提物ZCE-I和ZCE-II的生药量的2.5倍和2倍，但抑制率仅为17.08%（P<0.05）和0.58%（P>0.05），是ZCE-I和ZCE-II抑制率的25%和0.04%；说明紫草醇提物的抗炎效果好于水提物的抗炎效果。结论紫草不同浓度的醇提物和水提物具有较强的抗炎抑菌作用；首次通过实验阐明了紫草抑菌作用的活性部位及抑菌强度。

【关键词】  紫草； 二甲苯致小鼠耳部肿胀法； Kirby-Baue纸片扩散法； 活性部位

　　Abstract：ObjectiveTo study the anti-inflammatory effects（in vivo）and antibacterial effects（in vitro）of different concentration ethanol and water extracts from Lithospermum erythrorhizon.MethodsKirby-Bauer paper dispersion method was adopted to determine the antibacterial effects against Staphylococcus aureus,Proteus mirabilis,Escherichia coli,Candida albicans,Pseudomonas acruginosa,Streptococcus agalactiae,Shigella flexneri II. The method of xylene -induced ear swelling in mice was used to determine the anti-inflammatory effects of different ethanol and water extracts. Results①Compared with the positive control, the 80% ethanol extract showed the best antibacterial effects against Staphylococcus aureus,Shigella flexneri II and Streptococcus agalactiae, the antibacterial diameters were 11.17±1.26mm,10.33±1.54mm and 18.67±2.08mm, of which for anti-Streptococcus agalactiae effect was approach to the positive control drug erythromycin（the antibacterial diameter of erythromycin is 19.67±1.52mm）.The anti-inflammatory effects of the 50% ethanol and 20% ethanol extracts were weak relatively. The water extract had better anti-Candida albicans effect, the antibacterial diameter was 7.83±0.29mm. Every kind of extracts had inefficacy on Escherichia coli. ②The anti-inflammatory effect of extracts was positive correlated with concentration. The inhibitory rate of ethanol extracts ZCE-I（dosage 0.06g/ml）,ZCE-II（dosage 0.03g/ml） were 68.91%（**P<0.01） and 15.87%（*P<0.05）, the dosages of water extracts（ZCW-I/dosage 0.15g/ml,ZCW-II/dosage 0.06g/ml）） were 2.5 and 2 times of ethanol extracts, but the inhibitory rate were 17.08%（*P<0.05）and 0.58%（P>0.05），was 25% and 0.04% of the inhibitory rate of ZCE-I and ZCE-II；showing that the anti-inflammatory of the ethanol extracts are better than the water extracts. ConclusionThe ethanol and water extracts from Lithospermum erythrorhizon have strong anti-inflammatory and antibacterial effects. It is the first time that the antibacterial effective part and strength of Lithospermum erythrorhizon is elucidated through the experiments.

　　Key words：Lithospermum erythrorhizon；  Method of xylene causing the swelling ear in mice；  Kirby-Bauer paper dispersion method；  Effective part

    紫草是我国民间常用的中草药，以根入药。《中国药典》收藏的紫草有3个品种，即紫草科植物紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb.et zucc，新疆紫草Arnebia euchroma，pahnst，内蒙紫草Arnebia gutlata Bunge。新疆软紫草Arnebia euchroma（Royle） Johnston别名新疆紫草、新疆假紫草，其化学成分与硬紫草极为相似，紫草素及其衍生物的含量比硬紫草高8倍，被列为正品，在传统中药处方中用作抗炎、退热和抗菌药［1，2］。紫草的有效成分主要为两大类：一类是脂溶性很强的萘醌类色素，另一类是水溶性成分，主要是多糖，含量在2%左右［3］。现代药理学研究表明［4～7］，紫草还具有较好的抗生育、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、保肝护肝和对心血管系统的作用。由于临床应用广泛且对一些疑难杂症的治疗显现出较好的疗效，紫草一直受到广大药物工作者的重视。为了提高紫草在传统用药中的疗效，现对新疆软紫草的不同浓度的醇提物及水提物的抗炎和抑菌作用进行体内、体外实验研究，进一步明确紫草不同提取溶剂制备的活性部位发挥不同的药理作用，为最大限度地开发紫草的药理作用提供可靠的实验依据。

　　1  器材与方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  药材新疆紫草，购于山东甄城良还中药饮片有限公司（产地：新疆）。

　　1.1.2  动物昆明种健康小鼠，70只，雄性，体重18～22 g（泰山医学院实验动物中心提供）。

　　1.1.3  菌种金黄色葡萄球菌、奇异变形杆菌、大肠杆菌、白色念珠球菌、铜绿假单胞菌、无乳链球菌、福氏Ⅱ型杆菌（泰山医学院附属医院检验科提供）。

　　1.1.4  试剂和仪器营养琼脂（天津市英博生化世纪有限公司），药敏片（红霉素、复方新诺明、阿米卡星、氨苄青霉素、环丙沙星、氟哌酸、氯霉素等）（北京太洋药业有限公司），其它试剂均为国产分析纯；旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），分析天平（made for ohaus corp pine Brook NJ.USA），TMQ.R-3250自动台式灭菌器（山东新华医疗器械股份有限公司），超净台（苏州净化设备有限公司），HHB11电热恒温培养箱（天津市实验仪器厂），0.45 μm滤膜（上海亚净化器材厂），过滤器（上海瑞丽分离仪器厂），小鼠灌胃器，6.0 mm打孔器，微量加样器（上海求精生化试剂仪器有限公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 抑菌实验

    紫草不同浓度醇和水提物的制备：分别称取紫草粉末10 g，以80%的乙醇、50%的乙醇、20%的乙醇以及纯净水各80 ml浸泡3 h。将其放入超声振荡仪中，在40℃，100%的功率下，超声1 h，过滤，取其滤液。然后以1∶5的比例分别以同样的设置超声提取30 min，取其滤液。合并两次滤液，1 000 r/min离心30 min，取上清液，抽滤，将滤液用旋转蒸发仪蒸发浓缩，分别移至5 ml的容量瓶中定溶，标记，规定此溶液浓度为100%（生药含量2 g/ml）。分别在定容的各种紫草提取液中移出一定量的液体，用蒸馏水稀释至原浓度的50%（生药含量1 g/ml）及10%（生药含量0.2 g/ml）。标记待用。

　　Kirby-Baue纸片扩散法：以药敏片做阳性对照，生理盐水浸润的滤纸片作阴性对照。放入25℃的培养箱中培养24 h，用数显游标卡尺测量抑菌圈的直径(包括贴片),并记录测量数据，每组实验重复3次。判断标准：抑菌圈直径大于6 mm者判为有抑菌作用；抑菌圈直径小于或等于6 mm者判为无抑菌作用；3次重复试验均达到有抑菌作用结果者判为合格。阴性对照组应无抑菌圈产生，否则实验无效［8］。抑菌圈直径大于6 mm小于10 mm为低度敏感；大于10 mm小于15 mm为中度敏感；大于15 mm为高度敏感。

1.2.2 抗炎实验

    紫草醇提物、水提物的制备：分别取紫草90 g，以紫草∶无水乙醇或蒸馏水为1∶15的比例，回流提取1 h，过滤；再重复上述操作分别回流提取45 min和30 min。合并的滤液，用旋转蒸发仪浓缩至浸膏，加入生理盐水50 ml制备紫草醇提液ZCE-I（含生药0.06 g/ml）、ZCE-II（含生药0.03 g/ml）和水提液ZCW-I（含生药0.15 g/ml）、ZCW-II（含生药0.06 g/ml）。

　　二甲苯致小鼠耳部肿胀法：雄性小鼠70只，随机分组，共3个大组，即紫草醇提物组，紫草水提物组，生理盐水组（Control）；其中前两个大组每组又分为两个小组，分别为紫草醇提物ZCE-I，ZCE-II浓度组，紫草水提液ZCW-I，ZCW-II浓度组。每小组10只小鼠。每组小鼠用相应的药物或生理盐水灌胃（0.3 ml/10 g）；灌胃45 min以后，用50 μl 微量加样器涂二甲苯50 μl 于小鼠右耳正反两面；20 min后，脱臼处死小鼠，沿耳廓基线剪下双耳，用内径6 mm的打孔器于同一部位打孔，取下耳片，称重，计算左右耳重量差异及计算抑制率。

　　2 结果

　　2.1  紫草不同浓度醇和水提取物的抑菌作用与阳性对照比较，紫草的各种提取物均有一定的抑菌作用，并随提取物浓度的降低，抑菌效果减弱；其中80%的乙醇提取物对金黄色葡萄球菌、福氏Ⅱ型杆菌、无乳链球菌的抑制作用最强，抑菌圈直径分别为（11.17±1.26）mm（中度敏感）、（10.33±1.54）mm（中度敏感）和（18.67±2.08）mm（高度敏感），其中对无乳链球菌的抑制作用接近阳性对照药红霉素［红霉素的抑菌圈直径为（19.67±1.52）mm］。50%乙醇提取物和20%乙醇提取物的抑菌作用相对较弱。不同提取物对白色念珠球菌有一定抑制作用，其中水提物对白色念珠球菌有较好的抑制作用，抑菌直径为（7.83±0.29）mm（低度敏感）；水提物对奇异变形杆菌的抑制作用相对于醇提物也是最强的。与常用的大肠杆菌抑菌药氟哌酸（抑菌圈直径平均达到23.8 mm）比较，各种提取物对大肠杆菌均无抑制作用。结果见表1～2。表1  紫草醇提物和水提取物的抑菌作用（略）表2  紫草提取物抑菌定性实验结果（略）

　　2.2 紫草醇提物和水提物对二甲苯所致小鼠耳部肿胀的影响紫草醇提物组ZCE-I（含生药0.06 g/ml）和ZCE-II（含生药0.03 g/ml）与生理盐水组比较均有统计学意义（P<0.01或P<0.05），表明不同浓度的紫草醇提物均能降低小鼠耳肿胀度，有抗炎作用。由抑制率看，ZCE-I的抗炎作用最大，抑制率为68.91%，ZCE-II的抗炎效果偏低，抑制率为15.87%。结果见表3。

　　紫草水提液组ZCW-I（含生药0.15 g/ml）与生理盐水组比较有统计学意义（P<0.05），而ZCW-II（含生药0.06 g/ml）与生理盐水组比较差异不显著（P>0.05），表明较高浓度的紫草水提液能降低小鼠耳肿胀度，有抗炎作用，而低浓度的紫草水提液几乎无抗炎作用。抑制率表明抗炎作用强弱，紫草水提液组ZCW-I为17.08%，随着提取液浓度的降低，抗炎作用减弱，紫草水提液组ZCW-II的抑制率为0.58%，说明此浓度下已基本无抗炎作用。结果见表3。表3  紫草醇提物和水提物对二甲苯所致小鼠耳部肿胀的影响（略）

　　3 讨论

    从实验结果看，紫草各种提取物均有一定程度的抑菌作用。其中高浓度的乙醇提取物的抑菌效果最好，如80%乙醇提取物对无乳链球菌的抑制作用最强，接近阳性对照药红霉素的抑制效果。不同提取物对白色念珠球菌有一定抑制作用，其中以水提物的抑制作用最强，说明紫草的水提物对真菌有抑制作用。所有提取物均对大肠杆菌无效。所以在利用紫草治疗细菌引起的感染时，应选用高浓度的乙醇作为提取溶剂，制备其有效部位用于抗菌的治疗；如果选用紫草进行真菌类感染的治疗，应选用水作为提取剂，制备其水煎剂用于疾病的治疗。

药理实验表明，皮下注射紫草素（shikonin）10 mg/kg，对小鼠巴豆油耳炎症和大鼠酵母性足趾肿有明显抑制作用［1］。本研究以二甲苯作为致炎因子，通过小鼠耳廓水肿实验进一步证明了紫草的水提物及醇提物均有一定的抗炎作用；紫草的抗炎作用与浓度具有一定的相关性，在一定浓度范围内，其抗炎作用与给药浓度呈正相关；紫草醇提物的抗炎效果好于水提物，所以在提取中药材中活性成分时，应根据其溶解特性选择适宜的提取溶剂，将有效成分以最大量提取出来。因此，进行紫草抗炎和抗菌作用的实验研究，具有指导意义。

作者：赵雪梅，邓文，李莹，王桂玲，费洪荣，张颖，陈伟《时珍国医国药》

【参考文献】

  　　［1］王文杰,白金叶,刘大培.紫草素抗炎及对白三烯β4生物合成的抑制作用［J］.药学学报,1994,29（3）:161.

　　［2］吴寿金,赵 泰,秦永祺.现代中草药成分化学［M］.北京:中国医药科技出版社,2002:146.

　　［3］Fukui H,Hasan A F M F,Ueoka T，et al．Formation secretion of a new brown benzoquinone by hairy root cultures of Lithospermum erythrorhizon［J］.Phytochemistry,1998,47（6）:1037.

　　［4］谢冰芬,冯公侃,黄 河,等.天然紫草萘醌类化合物及其衍生物的抗瘤作用研究［J］.中国药理学通报,2006,22（4）:505.

　　［5］彭宗根,陈洪珊.紫草酸B的药理作用研究进展［J］.中国药学杂志,2003,38（10）:744.

　　［6］吴振,吴立军,田代真一,等.紫草素诱导A375-S2细胞凋亡的分子机制研究［J］.中国药理学通报,2005,21（2）:202.

　　［7］吴振,吴立军,田代真一,等.紫草素诱导HeLa细胞凋亡经过caspase激活的机制［J］.中国药理学通报,2004,20（5）:540.

［8］卫生部卫生法制与监督司.消毒技术规范［S］.北京:中华人民共和国卫生部,2002:48.

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