丹参水溶性成分与脂溶性成分抑菌作用的考察

【摘要】  　　目的考察丹参中水溶性成分与脂溶性成分的含量及其抑菌作用。方法采用HPLC法测定丹参素、原儿茶醛和丹参酮ⅡA含量；以平板二倍稀释法统计最小抑菌浓度（MIC），探讨其体外抑菌作用。结果丹参水溶性成分和脂溶性成分均对金黄色葡萄球菌标准株、临床株；大肠埃希菌标准株；铜绿杆菌标准株；大肠杆菌临床株1、临床株2有抑菌作用，两种抑菌药液均对金黄色葡萄球菌标准株、临床株作用最强，对大肠埃希菌标准株作用相对较弱；水溶性成分的抑菌作用强于脂溶性成分。结论丹参水溶性成分与脂溶性成分均具有一定的抑菌活性，提示该作用可进一步开发利用。

【关键词】  丹参 丹参素 原儿茶醛 丹参酮ⅡA 抑菌

　　Abstract:ObjectiveTo investigate the content of liposoluble and hydrosoluble constituents in Salvia miltiorrhiza Bge. and its antibacterial effect．MethodsThe contents of danshensu,protocateehualdehyde and salviolⅡA were determined by HPLC and the antimicrobial effect was obseved according to MIC by the method of plate doubling-dilution．ResultsThe liposoluble and hydrosoluble constituents of Salvia miltiorrhiza Bge. had some inhibition on all bacterial species in our experiments, especially the strongest on Staphylococcus aureus，the weakest on Bacillus coli; moreover, the hydrosoluble constituent had stronger effect than the liposoluble one.ConclusionThe antibacterial active components of Salvia miltiorrhiza Bge. need to make better use.

　　丹参Salvia miltiorrhiza Bge.属唇形科植物，其药用部位为干燥根及根茎，味苦，性微寒［1］，归心、肝经，具有祛淤止痛、活血通经、清心除烦等功效［2］，临床广泛用于活血化瘀、宁心安神、抗菌消炎和心脑血管疾患等症，是国内外现代化中药研究的热点品种之一［3］。丹参的化学成分主要为水溶性成分和脂溶性成分两部分。本文比较了多种提取方法，建立了从同一样品中分步先后提取脂溶性与水溶性成分，并应用高效液相色谱法优化筛选了色谱条件，使之在同一梯度条件下完成丹参中3种活性成分丹参素、原儿茶醛和丹参酮ⅡA的定量分析。丹参有关心血管方面的药理研究已相当深入，但其抑菌方面的研究报道较少，多为水煎液或对照品丹参酮ⅡA的抑菌报道，未见丹参的抑菌有效部位及其成分的抑菌研究。本实验先于定量之后，准确把握抑菌浓度再行相关抑菌研究,以期为临床应用其抗菌消炎作用提供科学依据。

　　1  仪器与材料

   

　　美国SSI高效液相色谱仪，分析之星色谱工作站，乙腈为色谱纯、水为双蒸水、磷酸为分析纯。丹参素钠对照品，原儿茶醛对照品，丹参酮ⅡA对照品(中国药品生物制品检定所)。丹参药材购自天津中药饮片厂（经天津中医药大学第一附属医院尚英和药师鉴定）。

   

　　金黄色葡萄球菌标准株，临床株；大肠埃希菌标准株；铜绿杆菌标准株；大肠杆菌临床株1，临床株2(均由天津医科大学微生物教研室提供)。

　　2  方法和结果

　　2.1  水溶性成分丹参素、原儿茶醛和脂溶性成分丹参酮ⅡA的测定

　　2.1.1  色谱条件色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相A:0.4%磷酸水溶液，流动相B:乙腈，流速为1.0 ml/min，检测波长为275 nm，柱温40℃,梯度洗脱：0～10 min，4%B；10～16 min，10%B；16～20 min,15%B；20～30 min,20%B；30～50 min,70%B；50～58 min,100%B。

　　2.1.2  对照品溶液的制备精密称取一定量原儿茶醛、丹参素钠对照品，各置10 ml棕色容量瓶中，加70％甲醇定容，均配成1 mg/ml溶液，后者相当于丹参素0.875 mg/ml，另称一定量丹参酮ⅡA对照品，以甲醇溶解按上述方法配成0.232 2 mg/ml的溶液；分别吸取丹参素钠、原儿茶醛和丹参酮ⅡA标准溶液各400，25，60 μl于1 ml容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得0.4 mg/ml丹参素钠、0.025 mg/ml原儿茶醛和0.013 93 mg/ml丹参酮ⅡA的混合对照品溶液(10℃以下保存)。

　　2.1.3  供试品溶液的制备取丹参药材置烘箱中50℃干燥，粉碎过60目筛。精密称取干燥粉末4 g，加95%乙醇100 ml于圆底烧瓶中,以索氏提取器提取1 h，控制温度75℃，收集提取液于100 ml容量瓶中，加乙醇稀释至刻度，摇匀，得脂溶性部位提取液。再加蒸馏水150 ml于圆底烧瓶中，在索氏提取器中继续提取16 h，注意控制温度保持微沸状态，浓缩提取液转至100 ml容量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀即得水溶性部位提取液，备用。各取以上提取液0.5 ml，混匀作为供试品溶液。

　　2.1.4  标准曲线的制备精密吸取“2.1.2”项下混合对照品溶液3，4，6，8，12，14 μl进样测定，以峰面积为纵坐标，质量为横坐标绘制标准曲线，计算丹参素、原儿茶醛、丹参酮ⅡA三者的回归方程分别为Y=334 759X-55 813（r=0.999 4）；Y=4E+06X-49 201（r=0.999 6）；Y=5E+06X+1 804.9（r=0.999 4）；知三者分别在1.2～5.6 μg，0.075～0.35 μg，0.042～0.20 μg范围内与峰面积线性关系良好。

　　2.1.5  精密度实验精密吸取同一混合对照品溶液10 μl，重复进样6次，测定峰面积，三者RSD分别为1.63%，1.34%，1.71%。结果表明，仪器精密度良好。

　　2.1.6  含量测定依法测定混样中脂溶性成分丹参酮ⅡA的含量为105.29 μg/ml，水溶性成分丹参素、原儿茶醛含量依次为347.6，290.4 μg/ml。

2.2  体外抑菌作用

　　2.2.1  药液的制备 将“2.1.3”项水溶性部位供试液，作为水溶性部位抑菌药液；同前将脂溶性部位供试液旋蒸，除尽乙醇溶剂后，以生理盐水溶解至1/4体积，作为脂溶性部位抑菌药液，备用。

　　2.2.2  培养基的配制 将MH琼脂加水煮沸融化后，分装于试管内，每管20 ml，高压灭菌（121℃）1 h，取出后，置于80℃水浴，备用。

　　2.2.3  含药琼脂平板制备根据实验设计，将已倍比稀释的不同浓度的抑菌药液分别加入已平衡的琼脂中充分混匀倾倒至灭菌平皿，琼脂厚度约4 mm。另设蒸馏水代替药液为阴性对照。

　　2.2.4  接种菌的制备 分别从保存菌种的培养基斜面上将上述各菌株移至培养基中,37℃培养18 h，制备浓度相当于0.5麦氏标准比浊管的菌悬液，相当于1.5×108/ml，在15 min之内接种。

　　2.2.5  琼脂稀释法进行最低抑菌浓度的抑菌评价用移液器取已校正浓度的待测菌液2 μl，滴加于含药琼脂表面，使用接种环将每一接种点直径控制在5~8 mm之间，待接种物被培养基吸收后，将平板置于35℃培养箱中，倒置培养18 h后观察结果。每个实验重复3次。凡肉眼无细菌生长的药物最低浓度为最低抑菌浓度（MIC）。

　　2.2.6  抑菌结果由表1可见，丹参水溶性成分和脂溶性成分均对金黄色葡萄球菌标准株、临床株；大肠埃希菌标准株；铜绿杆菌标准株；大肠杆菌临床株1、临床株2有抑菌作用，两种抑菌药液均对金黄色葡萄球菌标准株、临床株作用最强，对大肠埃希菌的标准株作用相对较弱。另外发现，水溶性成分的抑菌作用强于脂溶性成分。

　　表1  丹参水提液和醇提液的抑菌结果（略）

　　3  讨论

　　3.1  抑菌药液提取方法的比较对于脂溶性成分提取方法的筛选，先后考察了以乙醇作溶剂的索氏提取、热提及超声提取3种方法，其中索式提取含量最高，热提居中，超声提取最低，故本实验采用索式提取法。实验中还发现索提1h丹参酮ⅡA的含量高于2h，故确定1h提取，这可能与丹参酮ⅡA受热过长分解有关。对于水溶性成分提取方法的筛选，主要以水作溶剂比较了上述3种方法，其中也以索提最佳，提取时间根据HPLC分析，16 h提取完全。

　　3.2  色谱条件的优化2005版《中国药典》对于水溶性成分和脂溶性成分的含量测定，分别采用不同的色谱条件进行分析，本文经多次实验筛选，建立了同一色谱条件下同时测定水溶性成分丹参素、原儿茶醛及脂溶性成分丹参酮ⅡA3种成分含量的方法。实验中曾尝试了4种梯度，梯度比依次为①0～10 min，4%B;10～50 min，80%B;50～53 min,100%B；② 0～10 min,4%B；10～15 min,6%B；15～50 min,80%B；③0～10 min，4%B；10～16 min,16%B；16～20 min,26%B;20～25 min,30%B；25～50 min,80%B;50～53 min，100%B；第4梯度同前述。其主要区别在于10～50 min的两相配比的梯度变化不同。第1梯度，A相降低迅速，流动相极性变弱，水溶性峰堆积；第2梯度，虽增加一过渡平台，但流动相极性变化还是过快，峰形仍有叠加现象；第3梯度，流动相极性变化又过缓，不仅使脂溶性成分拖后，且与相邻峰重叠，采用第4梯度，水溶性成分保留时间恰当，脂溶性成分分离完全，峰形良好。

3.3  丹参抑菌活性实验的比较与以往文献对比［4，5］，丹参抑菌活性实验多采用水煎液或对照品丹参酮ⅡA作为抑菌药液，前者除裹带了过多杂质，还未提出脂溶性成分，即实际上降低了有效的抑菌浓度，导致最低抑菌浓度实验结果偏高；后者仅利用脂溶性成分，尚缺水溶性抑菌成分，也是不完全的实验结果。本实验从丹参中既提取水溶性成分又提取脂溶性成分，再进行抑菌试验，不仅成分确切，且浓度低于文献浓度［4］，这可能由于索提时丹酚酸类物质长时间受热水解为游离的丹参素，增加了抑菌活性的缘故。

 

作者：周静 李惠芬 王洪志 骆达 杜凡 王宇歆 吴咸中《时珍国医国药》

  　［1］ 国家药典委员会.中国药典，Ⅰ部［S］.北京:化学工业出版社,2005.

　　［2］ 韩永卫,林 敏.丹参的药理作用［J］.畜牧兽医杂志,2003,22(4):22.

　　［3］ 张兴国,程方叙,张 稷,等.贮藏期对丹参的总酮含量及抑菌效力的影响研究［J］.特产研究,2005,4:27.

　　［4］ 孙吉兰,常云亭,宋海英,等.丹参的体外抑菌作用研究［J］.时珍国医国药,2003,14(12):725.

　　［5］ 朱嘉蓉,罗厚蔚.丹参酮ⅡA的抑菌活性研究［J］.中国药科大学学报,2004，35(4)：368.