民族药响铃草的体外抑菌活性研究

【摘要】  　　目的探讨响铃草的体外抑菌作用。方法采用打孔琼脂扩散法和稀释法对响铃草不同溶剂提取物进行抑菌实验研究。结果响铃草的不同溶剂提取物对供试细菌和真菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌、绿脓杆菌以及黄霉菌）均有一定程度的抑制作用。结论响铃草提取物有明显的体外抑菌作用。

【关键词】  响铃草； 抑菌； 最小抑菌浓度； 抑菌圈

　　Abstract：ObjectiveTo study the antibacterial activities of different solvent extracts of Crotalaria ferruginea Grah.MethodsBy the agar diffusion and dilution method,minimal inhibitory concentration(MIC) and inhibitory circle of the extract were determined.ResultsThe antibacterial activity of the extracts was different to different microbes.ConclusionCrotalaria ferruginea Grah has good antibacterial activity in vitro.

　　Key words：Crotalaria ferruginea Grah;   Antibacterial;  MIC；  Inhibitory circle

　　响铃草为豆科狗屎豆属植物假地蓝Crotalaria ferruginea Grah的全草或带根全草［1］。响铃草为多年生草本，花期6～10月，生于山坡、荒地［2］。在贵州、云南较为常见，为贵州侗族常用药之一［3］。响铃草味苦、微酸、性寒，在贵州民间用于久咳痰血、耳鸣耳聋、头晕目眩、慢性肾炎、扁桃体炎、淋巴腺炎、疔毒恶疮以及月经不调等［4］。

　　目前文献中尚无响铃草的抑菌作用报道，本实验首次对其不同溶剂提取物对常见致病革兰氏阳性、革兰氏阴性菌以及黄霉菌的抑制活性进行了研究，为阐明其抗菌特性以及响铃草的进一步开发利用和寻找新的抗菌药物提供基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  材料与仪器

　　1.1.1  材料响铃草购于贵州省药材公司，产地：四川，包装批号060702 。

　　1.1.2  试剂石油醚，醋酸乙酯，甲醇，乙醇，95%乙醇，二甲基甲酰胺均为分析纯，购于贵阳中兴化学试剂公司。

　　1.1.3  菌种购自中国微生物菌种保藏中心，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus；大肠杆菌Escherichia coli；粪链球菌Enterococcus faecalis；黄霉菌Aspergillus flavus；绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa；藤黄微球菌Micrococcus luteus。

　　1.1.4  培养基MRS固体培养基：酪蛋白胨10 g，牛肉提取物10 g，酵母提取物5 g，葡萄糖5 g，乙酸钠5 g，柠檬酸二铵2.0 g，Tween 80 1.0 g，磷酸氢二钾2.0 g，MnSO4·H2O 0.2 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，CaCO3 20.0 g，琼脂15 g， 定容至1 000 ml，pH值 调至6.8；营养肉汤固体培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化钠5 g，琼脂15 g，定容至1 000 ml，pH值 调至7.0；查氏固体培养基：硝酸钠3 g，磷酸氢二钾1.0 g，MgSO4·7H2O 0.05 g，蔗糖30 g，琼脂15 g，液体培养基组成除了不加琼脂外，与相应的固体培养基相同。

　　1.1.5  仪器高低温恒温培养箱（上海一恒科技有限公司），旋转蒸发仪（BUCHI R-200），SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限公司），电子天平（OHAUS）净化工作台（上海市纯昱科学仪器有限公司），真空冷冻干燥机（LABCONCO），超低温冰箱（Forma Scientific），双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限公司TU-1901）。

　　1.2   方法

　　1.2.1  响铃草不同溶剂提取物的制备方法将干燥的响铃草粉碎过40目筛，称取等量的响铃草3份，每份150 g，分别置于1 000 ml的水、酒精、醋酸乙酯中。每种溶剂浸泡3次，每次置于恒温（37℃）揺床上（200 r/min）振荡12 h，抽滤得到提取液。水的提取液于-80℃冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；酒精提取液40℃减压旋转浓缩除去酒精，于-80℃冷冻过夜后用真空冷冻干燥机干燥；醋酸乙酯提取液先减压浓缩除去醋酸乙酯，得浸膏。

　　1.2.2  对响铃草不同溶剂提取物的抑菌活性检测

　　菌种培养：金黄色葡萄球菌staphylococcus aureus，大肠杆菌Escherichia coli，绿脓杆菌Pseudomonas aeruginosa，藤黄微球菌Micrococcus luteus采用营养肉汤培养基（组成成分见上）活化培养，粪链球菌Enterococcus faecalis采用MRS培养基（组成成分见上）活化培养，黄霉菌Aspergillus flavus采用查氏培养基（组成成分见上）活化培养，分别将各菌种浓度调至OD600约为1，待用。

　　采用试管稀释法对最低抑菌浓度（MIC）的测定：取上述得到的水和酒精溶剂的粗提物0.1 g，溶于 1 ml无菌水中，醋酸乙酯溶剂的提取物0.1 g溶于1 ml DMF，使其充分溶解，用细菌过滤器过滤，取0.3 ml样品溶液以相应的液体培养基倍比稀释成样品浓度分别为50, 25, 12.5, 6.25, 3.13, 1.57, 0.79 mg/ml，每管300 μl。分别在试管中加入30 μl菌液（OD600约为1），置于37℃恒温培养16 h。分别取100 μl菌悬液均匀涂板。然后放37℃温箱静止培养24 h后取出， 每梯度涂布3个平板。此过程重复两次，测定最小抑菌浓度（MIC）［5］，筛选出抑菌活性最强的组分。

　　抑菌圈的测定：取各溶剂的浸提物30 mg，分别用相应的溶剂（无菌水、乙醇、醋酸乙酯）1 ml，制成30 mg/ml的样品溶液，用细菌过滤器过滤。在相应的固体培养基平板上加0.1 ml菌液，均匀涂布。稍干后用8 mm打孔器打孔，每孔加0.1 ml样品，37℃培养24 h，测量抑菌圈大小。

2  结果

　　2.1  响铃草不同溶剂提取物MIC比较见表1。采用试管稀释法对响铃草3种溶剂提取物的最低抑菌浓度的进行测定，结果表明响铃草的3种溶剂提取物对供试的细菌及真菌具有不同的抑制作用：

　　水溶剂浸提物的总体抑菌活性较强，对藤黄微球菌、黄霉菌均有较好的抑制作用，最低抑菌浓度均为12.5 mg/ml；对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、绿脓杆菌的最低抑菌浓度均为50 mg/ml；对粪链球菌的最低抑菌浓度大于50 mg/ml。

　　乙醇溶剂浸提物的总体抑菌活性稍弱，对黄霉菌和绿脓杆菌的抑制作用较好，最低抑菌浓度均为25 mg/ml；对其它的供试菌的抑制效果较差，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、藤黄微球菌的最低抑菌浓度均为50 mg/ml；对粪链球菌的最低抑菌浓度大于50 mg/ml。

　　醋酸乙酯溶剂浸提物的抑菌活性显著，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌均有较好的效果，最低抑菌浓度均为12.5 mg/   ml；对其它的供试菌的抑制效果稍弱，对藤黄微球菌和黄霉菌的最低抑菌浓度均为25 mg/ml；对粪链球菌的最低抑菌浓度大于50 mg/ml。

　　从各种供试细菌及真菌对响铃草浸提物的敏感性上来看，不同菌种对不同溶剂提取物的敏感性不同：金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌对响铃草的醋酸乙酯提取物较为敏感，最低抑菌浓度均为12.5 mg/ml；藤黄微球菌和黄霉菌对于响铃草的水提物较为敏感，最低抑菌浓度为12.5 mg/ml；而粪链球菌对响铃草的3种溶剂浸提物均不敏感，最低抑菌浓度均大于50 mg/ml。

　　表1  响铃草不同溶剂提取物最低抑菌浓度（略）

　　2.2  响铃草不同溶剂提取物的抑菌圈结果见表2。与MIC的结果基本一致， 响铃草不同溶剂提取物对各种供试菌的抑菌活性不同，响铃草醋酸乙酯溶剂的提取物对金黄色葡萄球菌，大肠杆菌，绿脓杆菌和黄霉菌的抑制效果较强，抑菌圈直径大于10 mm；响铃草水浸提物对藤黄微球菌和黄霉菌的抑制效果较强，抑菌圈直径均大于10 mm；响铃草乙醇浸提物对黄霉菌的抑制效果较强，抑菌圈直径为11 mm。

　　从供试菌种对不同溶剂提取物的敏感性来看，金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和绿脓杆菌对于醋酸乙酯溶剂的提取物最为敏感，抑菌圈直径均大于10 mm；藤黄微球菌和黄霉菌对于响铃草的水浸提物最为敏感，抑菌圈直径均大于10 mm；粪肠球菌对3种溶剂的浸提物均不敏感，抑菌圈直径均小于5 mm。

　　表2  响铃草不同溶剂提取物抑菌圈直径（略）

　　3  讨论

　　近年来，由于抗生素的不合理使用导致了耐药菌株的增加，降低了现有抗生素的效率，严重地威胁着人类的健康。减少耐药菌株的生成以及研制新的抗菌药物已成为目前医学界的重要课题。中草药几千年来为中国人的健康作出了重大贡献，在现代预防和控制细菌性感染疾病方面也发挥了积极作用。由于中草药的特殊性，细菌较少对中草药产生耐药。因此，研究和开发抗菌中药对解决耐药菌株的产生和抗生素短缺问题具有重要意义［6］。

本实验首次对侗族药响铃草的水提取物、乙醇提取物、醋酸乙酯提取物的抑制部分细菌及真菌的作用进行了研究。我们采用体外微生物敏感试验测定方法，评价和比较了侗族药响铃草不同溶剂提取物的体外抑菌效果，实验结果表明响铃草不同溶剂提取物均有明显的体外抑菌作用。因此，本研究为其抗菌活性和抗菌机理的研究打下基础，也为进一步开发侗族药响铃草提供了研究数据，下一步的研究工作我们将对其进行活性指导下的活性化合物的进一步分离纯化。

作者：周英 王慧娟 段震  李燕黄赤夫《时珍国医国药》

【参考文献】

  　　［1］ 全国中草药汇编编写组. 全国中草药，第1版，下册［M］.北京：人民卫生出版社，1978：410.

　　［2］ 江苏新医学院. 中药大辞典［M］.上海：上海科学技术出版社,1977：1649.

　　［3］ 贵阳市卫生局. 贵阳民间药草［M］.贵阳：贵州人民出版社，1959：9.

　　［4］ 萧成纹，龙智忠，李向明. 侗族民间单方拾萃(九)［J］.中国民族民间医药杂志， 2002，6：358.

　　［5］ 沈 萍，范秀容，李广武. 微生物学实验，第3版［M］.北京：高等教育出版社，1996：6.

［6］ 曾春兰，钟振国. 中药抗菌作用的研究进展［J］.广西中医学院学报，2006，9（1）：51.

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