牡丹叶总黄酮抑菌活性研究

【摘要】  　　目的分别测定了牡丹叶总黄酮提取液、经大孔吸附树脂（D-101、HPD600）和超滤分离后的浓缩液对几种常见微生物的抑菌活性。方法以抑菌圈直径和最低抑菌浓度为指标。结果乙醇提取液对3种细菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为：大肠杆菌5.08 mg/ml， 枯草芽胞杆菌2.54 mg/ml，沙门氏菌1.27 mg/ml；HPD600大孔吸附树脂分离浓缩液对3种细菌的MIC值分别为：大肠杆菌4.92 mg/ml，枯草芽胞杆菌2.46 mg/ml和沙门氏菌1.23 mg/ml；D-101大孔吸附树脂分离浓缩液对3种细菌的MIC值分别为：大肠杆菌3.13 mg/ml， 枯草芽胞杆菌3.13 mg/ml和沙门氏菌0.39 mg/ml；超滤工艺分离浓缩液对3种细菌的MIC值分别为：大肠杆菌4.048 mg/ml，枯草芽胞杆菌4.048 mg/ml和沙门氏菌1.012 mg/ml。结论牡丹叶总黄酮对3种细菌均有一定的抑制作用，其中对沙门氏菌的抑制作用最为显著。

【关键词】  牡丹叶 总黄酮 抑菌活性 大孔吸附树脂 超滤

　　Abstract：ObjectiveTo study the antibacterial activity of the extraction solution and concentrated liquid of total flavonoids after separation of the macroporous resin (D-101, HPD600) and ultrafiltration from the leaves of peony. MethodsAntimicrobial circle diameter and minimum inhibitory concentration were used as the indexes. ResultsThe MIC of the ethanol extract to the three kinds of bacteria was as follows: E. coli 4.92 mg / ml, Bacillus subtilis 2.46 mg / ml, Salmonella 1.23 mg / ml; the MIC of the separation of the HPD600 concentrated liquid  to the three kinds of bacteria was as follows: E. coli 3.13 mg / ml, Bacillus subtilis 3.13 mg / ml, Salmonella 0.39 mg / ml; The MIC of the separation of the D-101 concentrated liquid  to the three kinds of bacteria was as follows: E. coli 4.048 mg / ml, Bacillus subtilis 4.048 mg / ml, Salmonella 1.012 mg / ml; The MIC of the separation of the UF concentrated liquid  to the three kinds of bacteria was as follows: E. coli 3.13 mg / ml, Bacillus subtilis 2.46 mg / ml, Salmonella 0.39 mg / ml.ConclusionThe total flavonoids from leaves of peony have a certain effect on the three kinds of bacteria, but the effect of Salmonella is the most notable respectively.

　　Key words：Leaves of peony;  Total flavonoids;  Antibacterial activity;  Macroporous resin;  Ultrafiltration

　　早期黄酮粗制品仅仅作为天然黄色素在染料方面应用，20世纪20年代国外把槲皮素与芦丁应用于临床后，逐渐引起了人们的关注。科学家先后研究确定了黄酮类化合物具有抗氧化、清除自由基、消炎、调节血脂、抗癌、抗HIV等广泛的生物活性。随着科研技术的提高和研究的不断深入，黄酮类化合物对微生物的抑制和杀灭作用逐渐引起了人们的重视。

　　近年来的研究更是涉及到具有抗菌能力的黄酮类化合物的分离提取方法，黄酮类化合物对微生物生物活性的作用、抗菌能力测定以及抗菌作用的构效关系等许多领域［1～8］。

　　牡丹Paeonia suffruticosa Andr. 为芍药科芍药属牡丹组落叶灌木，是重要的观赏植物和药用植物。近年来，对于牡丹花和丹皮研究逐渐增多，但是对于牡丹叶的研究报道极少，所以，研究牡丹叶总黄酮的抑菌活性可以为牡丹叶在食品工业、制药工业的应用提供一定的理论基础，加大其资源利用率。

　　1  材料与方法

　　1. 1  牡丹叶总黄酮

　　1.1.1  牡丹叶2008-04采于洛阳牡丹广场，品种：紫绣球。先将采集的牡丹叶去杂、漂洗晾干后在65℃下在电热恒温干燥箱中烘干24 h，经粉碎机粉碎，过40目筛分样备用。

　　1.1.2 总黄酮粗提液的制备准确称取1.0 g左右的牡丹叶粉末，置于250 ml圆底烧瓶中，精密加入25倍量60%的乙醇，在80℃条件下加热回流提取提取3 h，过滤，离心分离，用相应浓度的乙醇定容到100 ml，备用。黄酮纯度为5.27%。

　　1.1.3  大孔吸附树脂分离纯化牡丹叶总黄酮粗提液将牡丹叶干粉于60%的乙醇、80℃、料液比1∶25的条件下浸提3 h，抽滤，滤液于旋转蒸发器中50℃下减压浓缩至无醇味，回收乙醇。浓缩液用蒸馏水溶解，定容，测定吸光度，计算总黄酮含量，最后取一定量浓缩液再用蒸馏水定容，使其浓度为0.250 mg/ml左右，得稀释液。分别称取预处理好的大孔吸附树脂各8.0 g于250 ml具塞三角瓶中，加入样品溶液240 ml，室温下放置8 h，过滤，滤去树脂，用蒸馏水洗脱，洗至无醇味，再用160 ml的70%的乙醇水溶液进行洗脱6 h，过滤，旋转蒸发浓缩洗脱液，得样液，备用。HPD600得到的黄酮的纯度为15.11%，D-101树脂得到的黄酮纯度为17.60%。

　　1.1.4  牡丹叶黄酮的超滤分离用切割分子量为10 000 Da，膜面积为50 cm2 的超滤设备进行分离。黄酮纯度为40.58%。

1. 2  培养基的配制普通营养琼脂培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 ml。l kg f.cm-2灭菌15 min。

　　1. 3  菌悬液的制备把大肠杆菌(Escherichia coli) 、枯草芽孢杆菌( Bacillus subtilis)和沙门氏菌（Salmonella）原菌种接种于普通营养琼脂培养基斜面上，37℃培养20～22 h，用l0 ml灭菌生理盐水洗下菌苔备用。把上述菌悬液分别用灭菌的生理盐水配制成含菌数106cfu.ml-1的菌悬液。

　　1.4 抑菌活性测定采用滤纸片法［8］。

　　1.5 最小抑菌浓度(MIC)的测定采用两倍稀释法［9］。

　　2 结果

　　2.1  抑菌活性测定

　　2.1.1  牡丹叶总黄酮粗提液抑菌活性测定牡丹叶总黄酮粗提液抑菌活性效果见表1。表1  牡丹叶总黄酮粗提液对几种微生物的抑菌圈直径（略）

　　由表1可知，牡丹叶总黄酮粗提液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌都有较强的抑菌作用。对沙门氏菌的抑菌作用尤为强烈。对枯草芽孢杆菌的抑菌作用相对较弱。

　　2.1.2  HPD600树脂分离黄酮抑菌活性测定测定出HPD600树脂分离黄酮对于不同菌种的抑菌圈直径。见表2。表2  HPD600树脂分离黄酮对几种微生物的抑菌圈直径（略）

由表2 可知，HPD600树脂分离黄酮液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌有明显的抑菌作用，对沙门氏菌的抑菌作用尤为强烈。对大肠杆菌的抑菌作用相对较弱。

　　2.1.3   D-101树脂分离黄酮抑菌活性测定测定出D-101树脂分离黄酮对于不同菌种的抑菌圈直径。见表3。表3  D-101树脂分离黄酮对几种微生物的抑菌圈直径（略）

　　由表3 可知，D-101树脂分离黄酮液对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌有抑菌作用。对沙门氏菌的抑菌作用尤为强烈。对大肠杆菌的抑菌作用相对较弱。

　　2.1.4  超滤分离黄酮抑菌活性测定测定出超滤分离黄酮对于不同菌种的抑菌圈直径。见表4。表4  超滤分离黄酮对几种微生物的抑菌圈直径（略）

　　由表4可知，超滤分离黄酮对大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和沙门氏菌有抑菌作用。对沙门氏菌的抑菌作用尤为强烈。对大肠杆菌的抑菌作用相对较弱。

　　2.2 最小抑菌浓度(MIC)的测定(两倍稀释法)

　　2.2.1  牡丹叶总黄酮粗提液最小抑菌浓度(MIC)的测定牡丹叶总黄酮粗提液最小抑菌浓度(MIC)的测定结果见表5。表5  牡丹叶总黄酮粗提液对几种微生物的最小抑菌浓度（略）

　　 表5说明牡丹叶总黄酮粗提液对细菌确有较强的抑菌作用，MIC值分别为：大肠杆菌5.08 mg/ml， 枯草芽胞杆菌2.54 mg/ml，沙门氏菌1.27 mg/ml。

　　2.2.2  HPD600树脂分离黄酮最小抑菌浓度(MIC)的测定HPD600树脂分离黄酮最小抑制浓度结果见表6。表6   HPD600树脂分离黄酮对几种微生物的最小抑菌浓度（略）

　　表6 说明HPD600树脂分离黄酮对细菌确有较强的抑菌作用，MIC值分别为：大肠杆菌4.92 mg/ml，枯草芽胞杆菌2.46 mg/ml，沙门氏菌1.23 mg/ml。

　　2.2.3   D-101树脂分离黄酮最小抑菌浓度(MIC)的测定D-101树脂分离黄酮最小抑菌浓度(MIC)的测定结果见表7。表7   D-101树脂分离黄酮对几种微生物的最小抑菌浓度（略）

　　表7说明D-101树脂分离黄酮对细菌确有较强的抑菌作用，MIC值分别为：大肠杆菌3.13 mg/ml，枯草芽胞杆菌3.13 mg/ml，沙门氏菌0.39 mg/ml。

　　2.2.4 超滤分离黄酮最小抑菌浓度(MIC)的测定超滤分离黄酮最小抑菌浓度(MIC)的测定结果见表8。表8   超滤分离黄酮对几种微生物的最小抑菌浓度（略）

　　表8 说明超滤分离黄酮对细菌确有较强的抑菌作用，MIC值分别为：大肠杆菌 4.048 mg/ml，枯草芽胞杆菌4.048 mg/ml，沙门氏菌1.012 mg/ml。

　　3  结论

　　牡丹叶总黄酮对3种细菌均有一定的抑制作用，其中对沙门氏菌的抑制作用最为显著，对大肠杆菌的抑制作用相对较弱；乙醇提取液对3种细菌的最低抑菌浓度(MIC)分别为：大肠杆菌5.08 mg/ml， 枯草芽胞杆菌2.54 mg/ml，沙门氏菌1.27 mg/ml；HPD600大孔吸附树脂分离浓缩液对3种细菌的MIC值分别为：大肠杆菌4.92 mg/ml，枯草芽胞杆菌2.46 mg/ml，沙门氏菌1.23mg/ml；D-101大孔吸附树脂分离浓缩液对3种细菌的MIC值分别为：大肠杆菌3.13 mg/ml， 枯草芽胞杆菌3.13 mg/ml， 沙门氏菌0.39 mg/ml；超滤工艺分离浓缩液对3种细菌的MIC值分别为：大肠杆菌4.048 mg/ml，枯草芽胞杆菌4.048 mg/ml，沙门氏菌1.012 mg/ml。4种供试样品液最低抑菌浓度(MIC)测定亦说明：牡丹叶总黄酮对3种细菌均有一定的抑制作用，其中对沙门氏菌的抑制作用最为显著。

分离纯化的黄酮对沙门氏菌的抑制效果强于粗提总黄酮，说明牡丹叶黄酮是一种很好的沙门氏菌抑制剂，但具体是哪种黄酮成分在起作用还有待于进一步研究。牡丹叶黄酮粗提物对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用强于分离纯化的黄酮，可能还存在其它成分对这两种细菌的抑制作用，其作用机制还有待于更深一步的揭示。

作者：唐浩国，单方方，魏晓霞，李叶，刘严，向进乐，徐宝成  《时珍国医国药》

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