缬草油体外抑菌活性研究

【摘要】  目的探讨缬草油的抑菌活性。方法以索氏提取法和水蒸气蒸馏法提取的缬草油为试材，用管碟法和微量稀释法比较两种方法提取的缬草油对供试菌的抑菌活性、最低抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果两种方法提取的缬草油对细菌和真菌有一定程度的抑制作用。结论缬草油有抑菌作用，具很大应用潜力。实验结果为其在食品、化妆品行业的开发应用提供了依据。

【关键词】  缬草；挥发油；抑菌活性

　　Abstract：To investigate the inhibitory effects of the volatile oil from Valeriana officinalis L. Volatile oil was extracted from Valeriana officinalis L. by water steam distillation or Soxhlet method. Inhibition zone ,minimum inhibitory concentration (MIC) and minimal bactericidal concentration (MBC) were examined by using plate spread and micro dilution method . The results indicated that the Valeriana officinalis L. volatile oils showed considerable antimicrobial activity to tested bacteria and fungi . And the higher the concentration of the volatile oil is,the better the antimicrobial effect is.

　　Key words：Valeriana of ficinalis L. ;  Volatile oil;  Antimicrobial activity       

　　缬草Valeriana officinalis L.是一种败酱科、缬草属多年生草本植物［1］。缬草原产于亚洲，在北美、欧洲、日本和我国的湖南、云南、贵州、四川等省有广泛的分布。缬草的根和根茎具有很高的经济价值和药用价值［2］，我国民间很早就用于治痢疾、驱蛔虫、降血压、解痉挛等。从缬草根中提取的挥发油对神经衰弱、失眠、癫痫等有明显疗效［3］。同时缬草油还是名贵的天然香料，特别适用于配制高档烟的加香和食品的定香剂。许多植物挥发油由于其特殊的化学组成，在很多研究中表现出了很好的抗菌活性，成为新的高效低毒防腐剂的重要来源［4］。目前尚未有对缬草油体外抗菌作用的详细报道，本实验以水蒸气蒸馏法和索氏提取法提取缬草油为试材，进行体外抗菌作用研究，旨在拓宽缬草资源的应用范围，以期为进一步开发利用这一丰富的植物资源提供参考数据。

　　1 材料与仪器

　　1. 1 原料缬草，采于湖南省湘西自治州(经鉴定为宽叶缬草V．officinalis L．var．latifolia Miq．）

　　1.2 菌种枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus，大肠杆菌Escherichia coli，黑曲霉Aspergillus niger，青霉Penicillium citrinum， 根霉Rhizopus spl.。以上菌种均由中南林业科技大学发酵工程实验室提供。

　　1.3 培养基牛肉膏蛋白胨培养基(细菌用) ；马铃薯葡萄糖琼脂( PDA)培养基(真菌用) 121℃高压灭菌20 min,备用。

　　1.4 器材牛津杯，LAC-5060S高压灭菌锅，PYX-280S-A生化培养箱，HWY-100B恒温培养摇床，RE-52A旋转蒸发器，SHZ-D循环水式真空泵，SCW-CJ-2FD超净工作台。

　　2 方法

　　2. 1  挥发油的提取水蒸气蒸馏法［5］：取缬草50 g ，置于1 000 ml圆底烧瓶中，加入适量的蒸馏水使其润湿，水蒸气蒸馏4 h ，收集水-缬草油馏出液，将馏出液用乙醚萃取，乙醚相加适量无水硫酸钠脱水后，于40℃左右蒸干乙醚，收集挥发油。索氏提取法［6］：取缬草25 g ，用滤纸包成小包放入索氏提取器中，提取瓶内加入乙醚200 ml，然后固定在铁架台上，置于恒温水浴锅中(40～45 ℃) ，同时冷凝水回流，提取至提取器中液体无色，取出提取液，加无水硫酸钠低温干燥24 h 过滤，旋转蒸发挥去滤液中的乙醚，收集挥发油。

　　2. 2 体外抗菌试验

　　2.2.1 菌液制备

　　将保存菌种接种平板，于37 ℃培养24 h后，挑选典型菌落接种于肉汤中，再经37 ℃肉汤培养18 h后，以平板培养计数法测定其生长浊度，然后将菌液稀释至105 ～106 cfu /ml备用。

　　2.2.2 抑菌效果的测定

　　采用管碟法进行［7］。将熔化琼脂培养基冷却至50℃，加入适量的测试菌悬液与琼脂培养基混匀，吸取15 ml置平皿内，待凝固后，将牛津杯放置平皿菌层上，每杯加入药液0.25 ml，5%的山梨酸钾水溶液，作为抑菌活性测定的阳性对照，以稀释剂1 %吐温-80水溶液作对照，作为抑菌活性测定的阴性对照。置于恒温箱中培养（细菌在37 ℃下培养24 h ,真菌在28 ℃下培养48～72 h)，记录形成的抑菌圈直径。每组实验重复3次，实验结果取平均值 （±s）。

　　2.2.3 最小抑菌浓度(M IC)的测定

　　采用微量稀释法［8］。微孔板上的各孔中，依次加入用培养基二倍稀释的药物溶液，每孔200 μl，最后一孔不加药物(仅加培养基和细菌)为细菌生长对照孔，然后在每孔中加入稀释菌液50 μ1，另外留一列孔不加细菌(仅加培养基和药液)作药液对照孔，使得各孔中挥发油浓度分别50. 00 ，25. 00，12. 50，6. 25，3. 13，1.56 mg/ml，置于振荡器上振荡1 min使孔内溶液充分混匀，置于恒温箱中培养（细菌在37 ℃下培养24 h ，真菌在28 ℃下培养48～72 h)，无细菌生长孔所含最低药物浓度即为最小抑菌浓度。

　　2.2.4 最小杀菌浓度(MBC)的测定

　　取上述提取物最低抑菌浓度以上未见细菌生长的各管培养物，分别吸取100 μl，移至不含提取物的平皿琼脂培养基上，轻轻推开提取液，置37℃培养过夜，观察有无菌生长，计数少于5个菌落者即为该药的最低杀菌浓度(MBC) ［9］。

3 结果

　　3. 1 缬草油的抑菌效果

　　抑菌效果判断标准为（D为抑菌圈直径）：D≤8 mm为不敏感， 8 mm <D&LE;13 mm为中度敏感，D <D≤19 mm 13 mm为低度敏感，>19 mm为高度敏感。   

　　如表1所示，缬草油对大肠杆菌、枯草杆菌、金黄色葡萄球菌、青霉均有抑制作用。两种方法得到缬草油对细菌有抑菌效果，抑菌圈直径> 14.00 mm，而对根霉和黑曲霉的抑菌圈直径< 8.00 mm。缬草油对供试菌株的抑制效果顺序为：金黄色葡萄球菌> 枯草杆菌> 大肠杆菌> 青霉。表1  两种方法提取的挥发油对供试菌作用的抑菌圈直径（略）

　　3.2 缬草油对供试细菌的MIC

　　根据抑菌圈测定结果,对各受试菌种有作用的样品进一步实验测定MIC和MBC，缬草油对供试菌株的抑制效果顺序为：金黄色葡萄球菌> 枯草杆菌> 大肠杆菌> 青霉。这一结果与管碟法检测抑菌效果的作用顺序一致。表2  水蒸气蒸馏法提取缬草油的MIC（略）表3  索氏提取法提取缬草油的MIC（略）

　　由表2～3可以看出，缬草油对供试菌株均有一定的抑制作用，缬草油对供试菌株的 MIC为3.13～25.00 mg/ml。两种提取方法得到的缬草油对大肠杆菌、枯草杆菌和青霉的 MIC 相同；而对金黄色葡萄球菌的 MIC略有变化，这可能是由于提取的方法不同，所得到的精油含有多种成分且各成分的活性强度各不相同所致。同时，缬草油对霉菌的抑制效果弱于对细菌的抑制效果，可能因为含有利于霉菌生长的化学成分，削弱了抑菌活性成分对霉菌的抑制作用。

　　3.3  缬草油对供试细菌的M BC

　　从表2～3中未发生菌体生长的受试组中挑一环培养液，接种于固体培养基上，划线培养，观察，以产生菌落少于5个的受试组为试样对某供试菌株的最小杀菌浓度（MBC）。表4  两种方法提取缬草油的MBCmg·ml-1供试菌株索氏提取法提取（略）

　　表4中表明，缬草油对供试菌株均表现一定程度的杀灭作用，其中，对金黄色葡萄球菌效果较好MBC 为3.13～6.25 mg/ml；对青霉的效果相对较弱MBC 为25.00～50.00 mg/ml。两种提取方法得到的缬草油对各受试菌的MBC与MIC基本相同，说明缬草油对各受试菌有稳定的抑制作用。随着缬草油浓度的增加,抑菌的效果更好。

　　4 结论

    缬草油对金黄色葡萄球菌、枯草杆菌、大肠杆菌及毛霉有一定的抑制作用，对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均在16 cm以上最为敏感，对枯草杆菌和大肠杆菌的抑菌圈直径均在14 cm以上较为敏感。效果顺序为：金黄色葡萄球菌> 枯草杆菌> 大肠杆菌> 青霉。缬草油对供试菌株的MIC为3.13～25.00 mg/ml，MBC为3.13～50.00 mg/ml。两种方法提取的挥发油其抑菌作用基本一致，都对细菌作用抑制较强，对真菌的抑菌活性相对较差。试验中所用受试物为缬草油，其抑菌作用并非单一化合物的活性，可能是多种成分的协同作用，为了进一步了解缬草活性物质的抑菌机理，可对提取物进行分离纯化，深入探讨其活性物质的抑菌机理及其构效关系。   

　　影响抑菌活性的因素较多，如受试菌株的生长速度、受试液的扩散效果有关，水溶性越大，扩散性越大。在食品和化妆品体系中，微生物仅仅出现在水相，进入酯相中的防腐剂被认为是无用的损失。但是通过采取有效措施，提高缬草油的水溶性，便可使其更好地发挥抑菌作用。另外，缬草油具有特殊的芳香，亦可作为化妆品香料，这是其他防腐剂无法比拟的。缬草具有很多药理功能，开发其在抑菌方面的应用，可谓一举多得。

本实验表明，缬草油有抑菌作用，具有很大的应用潜力，可以作食品、化妆品等行业的抑菌剂进行开发。

作者：杨杰 李忠海 黄凌 黎继烈 文蓉 崔培梧《时珍国医国药》

【参考文献】

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　　［2］Piccinelli A L, Arana S. New lignans from the roots of Valeriana prionophylla with antioxidative and vasorelaxant activities［J］.J NatProd, 2004, 67 (7) : 1135.

　　［3］周琳，郭宝英，张静，等.缬草研究进展［J］.国土与自然资源研究，2004，30（3）：392.

　　［4］Tang Y F ,Zhang M L ,Huang B H . The extraction and antimicrobial activity of cinnamon oil［J］.Nature ProductResearch and Development ,2006 ,18 :432.

　　［5］陈屹，章银珠，孙石磊，等. 槐花精油的化学成分及其抑菌活性的研究［J］. 现代食品科技，2008，24(4)：318.

　　［6］杨云裳，张应鹏，马兴铭，等. 藏药短穗兔耳草有效部位的抑菌活性研究［J］.时珍国医国药，2006，17(10)：1184.

　　［7］唐裕芳,张妙玲,陶能国,等.苍术挥发油的提取及其抑菌活性研究［J］.西北植物学报,2008,28(3):588.

　　［8］倪语星，王金良，徐英春.抗微生物药物敏感性试验规范［M］．上海：上海科学技术出版社，2002：22．

［9］谢小梅,陈资文,陈和利,等. 花椒、肉豆蔻防霉作用的研究［J］.时珍国医国药,2001,12(2):100.

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