兔耳风提取物的抑菌作用研究

【摘要】  目的比较不同极性溶剂提取铁灯兔耳风与杏香兔耳风成分对3种常见微生物的抑菌作用。方法采用水、70%乙醇、95%乙醇及醋酸乙酯等不同极性的溶剂提取；用管碟法测抑菌圈的大小进行抑菌实验，用两倍稀释法进行最小抑菌浓度的测定。结果极性大的溶剂所提取出的成分对细菌（金黄色葡萄球菌）有明显抑菌作用，杏香兔耳风水提取物的最小抑菌浓度为6.25%,铁灯兔耳风水提取物的最小抑菌浓度为3.13%。极性小的溶剂提取出的成分对霉菌（白色念球菌）有抑菌作用。结论不同极性的提取物抑菌作用各不相同。

【关键词】  兔耳风；提取物；抑菌作用

　　Abstract：ObjectiveTo compare the effect of different polarity extracting reagents Ainsliaea macroclinidioides and A. fragrans on three kinds of common microorganisms. MethodsThe active substance was extracted from Ainsliaea with water, 70% ethanol,95% ethanol and ethyl acetate. The inhibitory effect  was determined by adopting the cup plate method.The minimal inhibitory concentration (MIC)was tested by double dilution method in tubes.Results The extracts from strong polarity solvent had obvious inhibitory effect on bacteria(Staphylococcus aureus), and the minimal inhibitory concentration  of  A. fragrans was 6.25%when it was extracted with water, A. macroclinidioides was 3.13%. The extracts from weak polarity solvent had inhibitory effect on fungus(Candida albicans). ConclusionAntibacterial effects of Ainsliaea extracts by different polarity solvent are different．

　　Key words：Ainsliaea;   Extracts;   Inhibitory effects

    兔耳风属Ainsliaea DC植物是菊科(Compositae)帚木菊族(Mutisieae Cass)，全世界七十余种,分布于亚洲东南部。中国植物志记载我国有44种4变种，除1种产于东北外，其余均产于长江流域及其以南各省。兔耳风属植物多为民间及地区常用中草药，广泛用于治疗感冒咳喘、风湿痹痛、跌打损伤、活血止血、肠炎痢疾、咽喉炎及泌尿系统疾病等症。目前，对本属植物的研究不多，且主要集中为化学成分方面［1～5］。本实验对杏香兔耳风和铁灯兔耳风的不同溶剂提取物的抑菌活性进行初步研究。

　　1  材料与仪器

　　1.1  菌种

　　1.1.1  细菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)（25923）、大肠杆菌(Escherichia coli)（25922）由江西省儿童医院检验科提供；

　　1.1.2 真菌白色念珠菌(Candida albicans)（90029）由江西省医科所微生物室提供。

　　1.2 仪器

 

　　SHZ-D(Ⅲ)循环水式真空泵,RE52-99旋转蒸发器,OLSB-5/10低温冷却液泵,高速中药粉碎机,培养皿,移液管,牛津杯,试管,HF-105A数控电热恒温培养箱，YXQ-SG46-280型手提式压力蒸气消毒器等。

　　1.3 培养基

　　金黄色葡萄球菌、大肠杆菌用血琼脂基础培养基培养，白色念球菌用沙氏培养基培养。

　　1.4 药材

　　铁灯兔耳风Ainsliaea macroclinidioides Hayata和杏香兔耳风A. fragrans Champ.均采自江西婺源，并经笔者鉴定。

　　2 方法

　　2.1  铁灯兔耳风提取物的制备

　　2.1.1 水提物

　　将铁灯兔耳风剪碎后，用粉碎机适当粉碎，称取200 g粉碎后药材置于5 000 ml烧瓶中，加入蒸馏水，浸泡30 min。置电热套中缓缓加热至沸，并保持微沸状态4 h，停止加热，趁热过滤，将水提液浓缩为浸膏。

　　2.1.2 醇提物

　　称取粉碎铁灯兔耳风药材100 g置于烧瓶中，加入95%乙醇，浸泡30 min，回流提取2次，第1次2 h，第2次1.5 h。过滤，合并滤液。回收乙醇，将滤液浓缩至浸膏状。同法可得70%乙醇提取物。

　　2.1.3 酯提物

　　称取粉碎铁灯兔耳风药材100 g置于1 000 ml烧瓶中，加入500 ml醋酸乙酯，浸泡30 min。回流提取2次，第1次2 h，第2次1.5 h。过滤，合并滤液。回收醋酸乙酯得浸膏。

　　2.1.4 样品制的制备

　　样品液的制备将铁灯兔耳风的4种提取物配制成含生药量为50g/100 ml的样品液。

　　2.2 杏香兔耳风提取物的制备

　　2.2.1 水提物

　　称取粉碎杏香兔耳风药材100 g置于烧瓶中，加入蒸馏水，其余步骤同铁灯兔耳风水提法。

　　2.2.2 醇提物

　　称取粉碎杏香兔耳风药材50 g置于烧瓶中，加入95%乙醇，其它操作同铁灯兔耳风乙醇提取物提取法。用70%乙醇提取，其它操作同上，得70%乙醇提取物。

2.2.3 酯提物 

　　称取粉碎杏香兔耳风药材45 g置于烧瓶中，其它操作同铁灯兔耳风醋酸乙酯提取物提取法。

　　2.2.4 样品液的制备

　　将杏香兔耳风的4种提取物配制成含生药量为50 g/100ml的样品液。

　　2.3 种菌的准备

　　在超净工作台上将大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌分别接种于各自培养基上，在37 ℃恒温培养箱中培养48 h。制成种菌备用。

　　2.4 培养基的准备

　　取30.4 g血琼脂培养基于锥形瓶中，加入800 ml蒸馏水；取6.6 g沙氏培养基及琼脂粉8 g于锥形瓶中，加入400 ml蒸馏水，与包扎好的培养皿、移液管、牛津杯、试管等一起放入灭菌锅中高压蒸气灭菌20 min(103.4 kPa)。

　　2.5 抑菌活性的测定

　　培养基倒好平板后，冷却至凝固。用接种环挑取上述活化后菌种，涂满整个平板，盖好平皿盖，于培养箱中培养24  h，制成含菌平板。然后在平板上等距离分散的轻轻放上4个牛津杯，在杯内分别注入100 μl样品液。以上操作均在无菌室内进行。

   

　　把每个处理过的培养皿放到如下条件培养：细菌37 ℃，24 h；霉菌24 ℃，48 h。测定抑菌圈直径，取其平均值。并以此判断兔耳风不同溶剂提取物对供试菌的抑制效果。

　　2.6 最小抑菌浓度(MIC)的测定(两倍稀释法)

　　根据抑菌圈的测定结果，选取金黄色葡萄球菌做最小抑菌浓度(MIC)的测定，选取杏香兔耳风和铁灯兔耳风的水、70%乙醇、95%乙醇提取物做为样品溶液。

   

　　挑取金黄色葡萄球菌一环接种于肉汤培养基中，放入培养箱培养24 h。取1支无菌试管倒入2 ml肉汤，接种已培养24 h的金黄色葡萄球菌一环，放入培养箱培养6 h。

   

　　取54支试管分为6组，每组9支。在1～6号试管中各加入1ml肉汤，并在1号试管中加入1 ml药液，从第2支试管开始依次从前支试管取1 ml混合液加入下一支试管并混匀。从6号试管中吸取的1   ml直接弃去。将7号试管加入1 ml肉汤，8号、9号试管加入1 ml药液。即每组试管样品含生药量浓度为：25，12.5，6.25，3.l3，1.56，0.78，0，50，50 g/100ml。将已培养6 h的菌液取出，各取一环加入10 ml肉汤中，适当振摇。用试管吸取，在1～8号试管中加入1滴含菌的肉汤。将上述试管置37℃培养箱培养。于 24 h取出，肉眼观察结果，液体浑浊管为阳性管，液体澄清管为阴性管 ，找出最低药物浓度的阴性管则为该种物质的最低抑菌浓度。

　　2.7 数据处理

　　实验数据均为3次平行实验结果的平均值。

　　3 结果

　　3.1 不同极性不同种类提取物抑菌活性比较

　　不同极性提取液对金黄色葡萄球的作用不同。见表1～2。其中杏香兔耳风水提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径可达30 mm，但醋酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌无抑制作用。同时，杏香兔耳风的抑菌效果要优于铁灯兔耳风。见图1～2。表1  杏香兔耳风不同极性提取物的抑菌圈直径（略）表2  铁灯兔耳风不同极性提取物抑菌圈直径（略）

　　3.2 最小抑菌浓度的比较

　　经过观察培养物中试管透明度，同时对培养物用涂布平板法检查细菌生长情况，计算兔耳风提取物的最小抑菌浓度。见表3～4。表3  杏香兔耳风提取物对金黄色葡萄球菌最小抑菌浓度（略）表4  铁灯兔耳风提取物对金黄色葡萄球菌的最小抑菌浓度（略）

    由表3～4可知，杏香兔耳风水提取物的最小抑菌浓度为6.25%，抑菌效果低于铁灯兔耳风（最小抑菌浓度3.13%）；但70%，95%乙醇提取物的最小抑菌浓度分别为3.13%，6.25%，则抑菌效果略高于铁灯兔耳风最小抑菌浓度。对照试管7号有大量菌生长。8，9号试管无菌。

　　4 讨论

    通过兔耳风不同溶剂提取物对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、白色念珠菌3种常见微生物抑菌作用的测定，结果表明，杏香兔耳风与铁灯兔耳风的四种不同极性提取物对金黄色葡萄球菌的抑制作用不同，抑菌作用由强到弱依次为：水>70%乙醇>95%乙醇，而醋酸乙酯提取物对金黄色葡萄球菌无抑制作用。由此表明，提取溶剂极性越强对金黄色葡萄球菌抑菌作用越强，并且随着浓度的增加，各提取物对金黄色葡萄球菌的抑菌活性都得以提高。杏香兔耳风与铁灯兔耳风的95%乙醇、醋酸乙酯提取物对白色念珠菌有一定的抑制作用；水、70%乙醇提取物对白色念珠菌无作用。但杏香兔耳风与铁灯兔耳风的四种不同极性提取物对大肠杆菌都无抑菌作用。

   

目前已将杏香兔耳风为主药制成片剂、颗粒剂和胶囊剂上市，主要用于治疗宫颈糜烂［6］、子宫内膜炎［7］等疾病。民间验方也有用杏香兔耳风配伍治疗热疖、鹅口疮、蛇咬伤等。兔耳风不同溶剂的提取物，对细菌、霉菌有不同的抑菌作用，甚至没有抑制作用，说明同一种药材里面存在着不同极性的抑菌物质，本文为其在民间及临床应用提供了一定的体外抑菌实验依据。

 

作者：葛菲　张晓伟　裴各琴　陈武　赖学文　刘庆华《时珍国医国药》

  　　［1］李翔，邓赟 ，张新申，等.叶下花挥发油化学成分的GC/MS分析［J］.化学研究与应用，2006，18(9)：1132.

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　　［3］王欣月，王英锋，刘波.药用植物杏香兔耳风挥发性成分研究［J］.首都师范大学学报（自然科学版），2006，27（4）：48.

　　［4］张锐，曾宪仪，张正行.杏香兔耳风的化学成分研究(Ⅱ)［J］.中草药，2006，37(3)：347.

　　［5］邢春秀，谢宁，杨念云，等.杏香兔耳风的化学成分［J］.江苏药学与临床研究， 2006，14（2）:107.

　　［6］潘翠金.复方杏香兔耳风治疗宫颈糜烂150例分析［J］.柳州医学，2000，12(4)：253.

［7］周嵘.复方杏香兔耳风颗粒治疗慢性子宫内膜炎54例疗效观察［J］.中国中医药科技，2000，7(6)：411