天然抗生素肽elafin与铜绿假单胞菌的相互作用

【摘要】  目的 观察天然抗生素肽elafin与铜绿假单胞菌的相互作用。方法体外细胞培养气道上皮A549细胞，将已构建好elafin克隆载体通过脂质体转染系统转染到A549细胞中，空质粒载体作为其对照，倒置荧光显微镜观察转染效果。空载体转染A549细胞(正常组)以及转染后的A549细胞分别用细胞培养液(对照组)和铜绿假单胞菌上清液(实验组)继续孵育24h。用ELISA法检测每组细胞上清液中elafin水平，Western Blot法检测细胞内elafin含量；孵育24h后，每组上清液取1ml加入到铜绿假单胞菌菌悬液中培养24h，用倍比稀释法测细菌数量。结果 对照组细胞的上清液中elafin水平(2.93±0.41)和细胞内elafin蛋白含量(0.23±0.05)，与正常组［(1.24±0.23)和(0.12±0.03)］有显著差异(均为P<0.01)。上述指标实验组［(8.54±0.99)和(0.74±0.18)］与对照组相比明显增加(均为P<0.01)；对照组细胞上清液中细菌数量［(5.62±0.75)×106/ml］与正常组细胞上清液中的［(6.78±0.98)×106/ml］也有差异(P<0.05)，实验组［(3.26±0.53)×106/ml］与对照组相比细菌数明显减少(P<0.01)。细胞上清液中elafin水平与细菌数呈一定的负相关(r=-0.59，P<0.05)。结论 铜绿假单胞菌能诱导elafin产生，反之elafin亦有一定的杀铜绿假单胞菌作用。

【关键词】  Elafin； 铜绿假单胞菌； 气道上皮细胞

    ABSTRACT  Objective  To observe the interaction of the natural antibiotic elafin and P.aeruginosa in airway epithelial cells.  Methods  After cultivating A549 cells in vitro, the constructed pEGFP-N1-elafin eukaryotic expression vector was transfected into the cells by LipofectamineTM 2000, and empty plasmid as a vector control. The A549 cells with pEGFP-N1-elafin vector were incubated for 24 hours in DMEM medium (control group), and the supernatant of P.aeruginosa (experimental group), and the cells with empty plasmid vector as normal group. The level of elafin secretion in supernatants and the content of elafin in the cells were detected by ELISA and Western Blot respectively. Meanwhile the supernatants (1ml) of the three groups after incubated 24 hours were added into the culture of P.aeruginosa, and at the same time, the number of bacteria of each group was detected by two-fold dilution method.  Results  The level of elafin secretion and the content of elafin in the cells in control group ［(2.93±0.41) and (0.23±0.05)］ were increased compared to normal group ［(1.24±0.23) and (0.12±0.03)］ (P<0.01), while those of experimental group ［(8.54±0.99) and (0.74±0.18)］ were obviously higher than those of in control group (P<0.01). The number of bacteria of normal group ［(6.78±0.98)×106/ml)］ and control group ［(5.62±0.75)×106/ml)］ were different (P<0.05), the number of the experimental group ［(3.26±0.53)×106/ml)］ was reduced significantly compared tocontrol group (P<0.01). The level of elafin secretion and the number of bacterial in supernatants were apparently in negative correlation.  Conclustions  P.aeruginosa could induce the production of elafin, and in turn, elafin had some inhibition activity against P.aeruginosa.

    KEY WORDS  Elafin;  Pseudomonas aeruginosa;  Airway epithelial cell

    铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)引起的医院感染(尤其是肺部感染)在近年已很常见，在很多大型医院铜绿假单胞菌占分离菌的首位。铜绿假单胞菌引起的感染，因其很容易形成生物膜致使病原菌很难被清除，常常导致感染的反复发作，是难治性肺部感染的重要原因［1］。近来国外的研究显示很多因素均可以诱导天然抗生素肽elafin表达增加，其除了作为蛋白酶抑制剂具有能够抑制气道黏液高分泌和对气道上皮细胞的保护作用外，还具有抑杀铜绿假单胞菌的功能。本研究旨在通过观察elafin重组到气道上皮细胞后，Pa是否具有诱导elafin的作用，以及它与Pa有无相互作用，并了解elafin对呼吸道感染常见细菌的抗菌作用，为其治疗Pa慢性肺部感染提供一定的理论依据。

    1  材料与方法

    1.1  细胞株、培养液及菌株

    肺上皮细胞株A549由重庆医科大学病理生理教研室保存；Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM，美国Gibco/BRL公司)，不含血清和抗生素的1640培养基(RPMI-1640，美国Gibco/BRL公司)；黏液型Pa菌株由重庆医科大学附属第二医院细菌室4℃保存；Mueller-Hinton肉汤(MHB，美国Difco公司)。

    1.2  试剂

    酶联免疫吸附测定(ELISA)试剂盒(武汉博士德生物公司)，Western blot试剂盒(上海康成生物工程有限公司)，转染试剂LipofectamineTM 2000(北京同正生物科技公司)，重组载体pEGFP-N1-elafin由本研究组杨捷博士克隆并构建［2］。

    1.3  主要实验仪器

    24孔平板(天津塑料制品厂)，麦氏比浊仪(法国Bio-Merieux公司)，倒置荧光显微镜(Olympus IX-70)，薄层色谱扫描仪(CD60，德国Desaga公司)。

    1.4  A549细胞的培养以及转染

    A549细胞常规复苏后，加入适量含10%胎牛血清、1% L-谷氨酰胺及1%青霉素和链霉素的DMEM，置于37℃、5% CO2的孵箱中孵育。用24孔板，按照LipofectamineTM 2000转染试剂说明步骤进行转染。经荧光倒置显微镜确认转染效率。

    1.5  实验分组与诱导孵育

    ①正常组：重组未含elafin基因空载体的细胞，在DMEM培养液孵育24h；②对照组：将重组后的细胞经DMEM培养液孵育24h；③实验组：重组后的细胞加用Pa上清液(1.5×108CFU/ml的Pa菌悬液200μl在1.8ml MHB中孵育24h)0.5ml孵育诱导24h。

    1.6  ELISA法检测细胞上清液elafin水平

    采用ELISA法检测三组细胞孵育后的上清液中elafin水平。抗elafin IgG(1∶500)包被及后续步骤按ELISA试剂盒说明书操作，在ELISA检测仪上，于450nm处，以空白对照孔调零后，各孔细胞上清液elafin相对水平用所测得的吸光度A值表示。

1.7  Western Blot检测细胞内elafin含量

    各组细胞孵育24h后，用0.01mol/L磷酸缓冲液清洗3遍，按常规方法提取蛋白，15%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE，电压200V，60min)分离蛋白质。分离后的蛋白按常规方法转移至硝酸纤维素膜上、封闭，加入鼠抗elafin一抗，4℃孵育12h，TBS洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗大鼠IgG检测elafin的表达，阳性条带以化学发光法显示在感光胶片上，重复3次。用Image J分析软件分析图片上每个特异条带灰度值(光密度面积积分)，所得结果代表elafin蛋白的相对含量。

    1.8  上清液中细菌数的测定

    各组细胞孵育24h的上清液1.0ml，分别加入到用MHB配制的1.5×108CFU/ml的Pa菌悬液1.0ml，置37℃、5% CO2的孵箱中孵育24h后，用倍比稀释法检测上清液中细菌数。

    1.9  统计学处理

    采用SPPS10.0统计软件，检测结果均以x±s表示，组间差异的显著性用方差分析的q检验，两变量的相关程度用直性相关分析法分析，以P<0.05作为差异的显著性。

    2  结果

    2.1  转染后观察elafin转染情况

    通过LipofectamineTM 2000将elafin克隆载体转染到A549细胞，36h在荧光倒置显微镜下观察到部分细胞出现绿色荧光，计数显示转染效率约为35%，空载体则未见荧光。

    2.2  细胞elafin水平

    不含elafin基因的空载体正常与细胞内含elafin的对照组相比，后者含elafin的水平明显高(均为P<0.01)；而经铜绿假单胞菌上清液诱导后，实验组比对照组含elafin水平则明显升高(均为P<0.01)，结果见Tab.1。

    2.3  上清液中细菌数的测定

    对照组细菌数量(5.62±0.75)×106CFU/ml与空载体正常组(6.78±0.98)×106CFU/ml相比明显偏低(P<0.05)；实验组的细菌数(3.26±0.53)×106CFU/ml较对照组更低(P<0.01)，结果见Tab.1。

    2.4  上清液elafin水平与细菌数的关系 

    细胞上清液elafin的水平与菌悬液中的活细菌数成负相关(r=-0.59，P<0.05)。

    3  讨论

    Pa是广泛分布于自然界的人类条件致病菌，它对正常人不致病，人对它的防御机制为白细胞及黏膜纤毛系统局部屏障功能。Pa呼吸道感染常继发于宿主免疫功能受损后，尤其易发于原有肺部慢性病变基础上，如慢性支气管炎、支气管扩张、气管切开、应用人工呼吸机后。Pa在慢性气道炎症中常形成生物膜而抵抗常用抗生素的杀菌作用，形成持续感染，是难治性肺部感染的主要原因之一［3］。

    本研究通过构建好的pEGFP-N1-elafin与阳离子脂质体转染试剂LipofectamineTM 2000转染到气道上皮细胞中，倒置荧光显微镜观察表明转染成功，具有一定的表达效率。

Elafin在呼吸道主要是由Ⅱ型肺泡上皮细胞、Clara细胞以及肺泡巨噬细胞在炎性刺激诱导下表达［4］，细菌以及常见致炎因子及炎症反应顺序产物均能诱导elafin的产生［5］。本研究显示铜绿假单胞菌产物孵育后细胞上清液中elafin的含量以及细胞内elafin蛋白表达水平有增加，提示Pa具有明确的elafin表达诱导作用，且同时具有促分泌效应，说明它是肺组织保护性因子产生的有效诱导物。Elafin为特异性蛋白酶抑制剂、低分子量阳离子肽和在黏膜部位出现的特性，使之具有直接的抗微生物活性［6］，国外研究表明其在体外能积极抗革兰阴性、革兰阳性细菌、真菌、病毒等病原微生物。虽然Pa对elafin有一定的破坏作用，但适当浓度的Pa可使气道局部elafin的总水平增加，使elafin与Pa处在高水平的动态平衡，杀灭部分Pa导致细菌数量减少。本研究结果显示，转染elafin后的A549细胞在含有铜绿假单胞菌的细菌培养基中孵育后，随着细胞上清液中elafin水平的增加，细菌数量显著减少，两者呈现出一定的负相关。这与国外的研究显示elafin能积极地抑杀体内细菌性病原体Pa［7］一致。Elafin的这种体内天然的抗蛋白酶抑制剂以及其独特的抗菌特性和与Pa的相互作用的关系，显示了它与人工合成抗生素在治疗慢性肺部感染性疾病(尤其是铜绿假单胞菌感染)的优越性。

  作者：聂晓红 周向东 黄长武  《中国抗生素杂志》

【参考文献】

  ［1］ Kobayashi H. Airway biofilm disease［J］. Int J Antimicrob Agents,2001,17(5):351

［2］ 杨捷，周向东. 天然内生多肽elafin真核表达载体的构建及其在真核细胞的表达［J］. 中国抗生素杂志，2005，30(10)：608

［3］ Costerton J W, Stewart P S, Greenberg E P, et al. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections ［J］. Science,1999,284(5418):1318

［4］ Pfundt R, van Ruissen F, van Vlijmen-Willems I M, et al. Constitutive and inducible expression of SKALP/elafin provides anti-elastase defense in human epithelia ［J］. J Clin Invest,1996,98(6):1389

［5］ Meyer-Hoffert U, Wichmann N, Schwichtenberg L, et al. Supernatants of Pseudomonas aeruginosa induce the Pseudomonas-specific antibiotic elafin in human keratinocytes ［J］. Exp Dermatol,2003,12(4):418

［6］ Sallenave J M. Antimicrobial activity of antiproteinases［J］. Biochem Soc Trans,2002,30(2):111

［7］ Simpson A J, Maxwell A I, Govan J R, et al. Elafin (elastase-specific inhibitor) has anti-microbial activity against Gram-positive and Gram-negative respiratory pathogens ［J］. FEBS Lett,1999,452(3):309

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