【摘要】 针对环境中的压力，细菌会采取不同的响应以维持自身的稳定。某些抗生素能够诱导肺炎链球菌转变为感受态细胞，提高细胞转化率，从而产生更适宜生存的耐药突变株。本文根据近年来有关感受态的研究，重点阐述肺炎链球菌中抗生素诱导的感受态与耐药性之间的关系。
【关键词】 肺炎链球菌； 抗生素； 感受态； 转化； 耐药性
Antibiotic stress induced competence and the drug
ABSTRACT Bacteria took different general responses to stress conditions for survival. In response to antibiotic stress, Streptococcus pneumoniae used competence as a fitnessenhancing strategy. Transformation contributed the genetic plasticity and played a central role in the pathogen adaptive resistance to the antibiotic therapy. This review focused on the relationship between competence and bacterial antibiotic resistance.
KEY WORDS Streptococcus pneumoniae; Antibiotics; Competence; Transformation; Resistance
1 经典理论中细菌耐药性和抗生素压力
青霉素的发现和使用，开启了抗菌治疗史上伟大的篇章。抗生素对于人类的健康事业功不可没，但短短几十年过后MRSA、VRE及其它耐药菌的相继出现，使这些曾经风光的抗生素陷入了两难的境地。关于耐药菌的出现，经典理论认为，自然界中存在固有的耐药菌和耐药基因，它们通过质粒传递或转座子转移等基因交流的方式，将耐药基因传递给一些致病菌，从而产生了难以控制的超级耐药致病菌如MRSA和VRE等［1］。对于耐药菌而言，抗生素起到了一种筛选的作用：将药物敏感性细菌杀死，为耐药菌的生存排除了竞争的阻力，有利于耐药菌群的生存和繁殖。
抗生素在临床治疗中的广泛和长期使用，不可避免地导致耐药菌的出现，给抗菌治疗带来了许多困难。另外，抗生素作为促生长剂被添加到动物饲料中，也是耐药菌出现的诱因之一。这些用于饲料的抗生素大多数可以人畜共用，长期使用后筛选出的耐药菌在人畜间传递很容易导致多种抗生素失效［1］。现在的临床研究发现，耐药菌出现频率越来越高，耐药程度越来越严重，如果仅仅归咎于抗生素筛选出的固有耐药菌，恐怕难以圆满的解答。
抗生素同紫外线、离子射线、重金属和化学诱变剂一样，是一种环境压力，对细菌的生存造成一定程度的威胁，甚至通过对菌体的损伤导致其死亡［2］。而细菌无处不在，充分说明了这一种群在各种恶劣环境中强大的生存能力和适应性。在遭受到环境压力时，细菌会采取不同的应急策略来规避风险、修复损伤，甚至改变自身的结构来适应各种环境的变化，如UV照射下大肠埃希菌的SOS反应，高温环境下的热休克反应和芽孢的形成等等，这些都是细菌针对某种特定压力的响应。 有研究表明，当有抗生素作用时，细菌并不是平静地面对死亡，它们中的一些亚群也会产生某些对于抗生素压力的响应，如丝裂霉素C和喹喏酮在大肠埃希菌中诱发出的SOS反应。SOS反应是细胞的一种易错修复机制，通过提高突变率降低菌体的死亡率［3，4］。但SOS反应并不是细菌中普遍存在的规律性反应，自然界仍存在许多非SOS型细菌，它们因为缺乏SOS反应体系，不能通过可诱导的修复来达到适应环境的目的，因此必须通过其它途径加以补救。肺炎链球菌就是一种非SOS型细菌，在其菌体中没有检测到SOS反应相关的作用因子［5］。有实验证明，肺炎链球菌中可诱导的感受态反应可作为一种SOS反应的替代，通过转化作用最终产生更适宜生存的突变菌株［2］。
2 抗生素诱导的肺炎链球菌感受态
2.1 感受态和感受态调节系统
转化，是一种基因交换的程序性机制，最早在肺炎链球菌中发现，现已证明存在于大多数细菌中。具有转化能力的细菌在其生长的某一阶段能够自然形成感受态，在此状态下的细胞具有吸附、吸收外源裸露DNA片段的能力。能够产生感受态的细菌中普遍存在着一组受com调节子严密调控的感受态基因，在感受态刺激因子(competence stimulating peptide，CSP)的作用下开启基因的表达，用于完成吸收并重组外源DNA的生命活动［6～8］。
由于肺炎链球菌对感受态刺激因子的作用反应迅速且高度同步，因此是研究感受态十分理想的模型［9，10］。肺炎链球菌中感受态基因的数量从最初发现的47个增加到124［9］或105［10］个(不同的文献报道)，几乎所有的基因都被组织在相邻的基因簇中，被com调节子共同调控。它们按照功能和表达时间的先后，被划分为早期感受态基因和晚期感受态基因。早期基因主要对感受态的形成起调节作用，并进一步促使晚期感受态基因的表达；晚期感受态基因主要负责细胞对外源DNA的吸附、吸收和重组［7］。
在肺炎链球菌com调节子所调控的基因中，仅22个基因为转化所必需，其中8个基因(comA/B，comC/D/E，comX1comX2和comW)是早期基因组中的成员，编码的产物存在于感受态调控级联反应中［11，12］。肺炎链球菌感受态刺激因子(CSP)为comC基因的表达产物，被ComAB蛋白成熟并转运。comC编码一个45个氨基酸残基的感受态前导肽，ComAB蛋白从此前导肽的GlyGly结构后切割出成熟的17个氨基酸残基的小肽即成熟的CSP［8，13］。
comD/E是一个二因素调节单位，受CSP的调控。comD的基因产物为CSP的受体，是一种跨膜蛋白，含有7个跨膜的α螺旋。ComD具有组氨酸激酶的活性，与相应的CSP结合后可磷酸化激活ComE蛋白。ComE蛋白为一转录因子，被激活后产生多重效应：一是与操纵子comC/D/E的启动子结合促进这三个基因的表达，形成自身诱导的正反馈效应；二是可激活具有σ因子活性的ComX蛋白，而ComX同RNA聚合酶形成复合物，启动感受态晚期基因的表达。comW基因被认为是一种感受态所必需的依赖ComE的调节子，它通过阻止ClpP依赖的蛋白水解酶对ComX的水解作用来稳定ComX蛋白同RNA聚合酶的复合物，同时通过一些尚未明晰的机制来活化此复合物，使晚期基因的表达更加严密地被ComE传导的信号所调控［14，15］(图1)。
在com调节子控制的22个转化必需基因中，剩余的14个基因属于晚期基因，它们编码的蛋白质用于DNA的吸收(ccl，comEA/C，comFA/C，comGA/B/C/D/G)和处理单链DNA(coiA，dprA，recA和ssbB)［11］。至少有70个基因对转化是非必需的，但由于感受态基因具有很多的重叠，因此它们不能被去除，并同时具备一些基因重叠后才有的功能［9］。这些“多余”的基因和功能说明com调节子的作用不仅仅是诱导细胞形成感受态，还可能有着其它的作用。有研究者认为“感受态”已经不足以描述肺炎链球菌中comX所决定的生理状态，因此开始倾向于使用一个中性化而不带任何功能的词语“X态”(X state)来描述这一生理状态［16］。
2.2 抗生素诱导的细菌感受态
对比丝裂霉素C在大肠埃希菌中诱发出SOS反应［17］，研究者在肺炎链球菌中进行了相关试验，使用了一个可转录的融合基因ssbB::luc，即一个Photinus 肺炎链球菌感受态调控系统pyralis内的可以编码荧光素的报告基因luc和感受态晚期基因组中的ssbB的融合体［18］。ssbB基因是感受态晚期基因组中的一个代表，同时在SOS相关基因中也存在，它能够编码单链DNA结合蛋白SsbB，在基因重组中起到不可或缺的作用。加入一定浓度的丝裂霉素C后，观察到融合基因表达水平上升，提示丝裂霉素C能够诱导肺炎链球菌中重组相关基因ssbB的表达。对照实验中采用一株com基因缺陷菌株，在加入丝裂霉素C后融合体不被表达［3］，这说明丝裂霉素C诱导重组相关基因ssbB的表达，需要在细胞具有完整的com基因的前提下进行，即细胞需要通过诱发感受态来开启同源重组的生理活动。以上试验证明某些抗生素如丝裂霉素C能够诱导肺炎链球菌中com基因的表达，使正常细胞转变为感受态细胞，促进细胞内部的转化作用。
除了丝裂霉素C，氟喹诺酮类抗生素在肺炎链球菌中也能诱发感受态基因的表达［2，19］。丝裂霉素C通过阻碍复制叉的前进而影响染色体的复制；喹诺酮类抗生素(氟哌酸，左氧氟沙星和莫西沙星)的作用靶点是DNA解旋酶(拓扑异构酶II)，通过使拓扑异构酶与DNA发生共价交联阻止DNA的复制［19，20］。由此可见，这两类抗生素的作用机制都是阻碍细菌染色体的复制，当它们作为细菌生存环境中的压力时可能传递着相同的信号，即在肺炎链球菌中可以诱发出相同的响应——感受态。
在其它抗生素试验中，对于肺炎链球菌感受态的诱发情况各不相同。作用靶点为核糖体的抗生素很多，如氨基糖苷类抗生素、四环类抗生素和大环内酯类抗生素等，但由于核糖体内可作用的靶点较多，这些抗生素对感受态诱发的情况和机制更复杂。实验表明氨基糖苷类的卡那霉素和链霉素可以在肺炎链球菌中诱导出感受态，而大环内酯类的红霉素和四环素则无此作用［2，3］。并不是所有对DNA或RNA有损伤性的抗生素就一定能够诱导出感受态，DNA促旋酶抑制剂新生霉素和RNA聚合酶抑制剂利福平就没有这种诱导的作用。另外，糖肽类抗生素中的万古霉素，β内酰胺类抗生素和第三代的头孢菌素头孢噻肟同样也不能诱导细胞转变为感受态［3］。究竟具有哪些特征的抗生素能够诱发细胞形成感受态，目前尚未有定论。
3 肺炎链球菌感受态与耐药突变
在肺炎链球菌中多种抗生素能够诱导细胞转变为感受态，这种转变为遗传转化做好了生理上的准备。为了证明抗生素诱导的感受态细胞能够有效率地进行遗传转化，研究者设计了一个试验：将携带链霉素耐受基因的DNA片段加入到肺炎链球菌培养物中，同时加入一定剂量(625ng/ml)的链霉素，并用无链霉素添加的培养物作为对照。链霉素必须适量，避免导致菌体大规模死亡。结果显示，在链霉素处理过的培养物中出现了耐受，而对照实验中则没有出现耐受，因此可以确定链霉素诱发的感受态细胞能够有效吸收外源DNA用于同源重组。如果再加入一定量的CSP(100ng/ml)并不会进一步提高肺炎链球菌的转化率，即抗生素能够通过诱发感受态提高菌体的转化效率，且这种诱发作用不依赖于CSP的含量［3］。同样条件用丝裂霉素C或诺氟沙星替换链霉素重复此试验，能够观察到同样的现象。
当抗生素诱导细胞出现感受态后，细胞就能有效率地吸收合适的外源DNA片段，这为耐药突变的出现提供了先决条件。但在肺炎链球菌群落中，如何有效率地获取足够并且合适的外源DNA用于遗传转化是研究人员关注的另一个问题。
针对肺炎链球菌的研究表明，同一个群落里的细菌可以依照不同表型分为若干个亚群。就可否诱导出感受态而言，分为感受态型细胞和非感受态型细胞［21，22］，这些不同亚群的细胞在遗传背景上存在着某些差异。现在有研究者认为，正是这些不同亚群的细胞，为遗传转化提供了丰富的基因资源。在抗生素的作用下，一个细菌亚群被诱发成为感受态细胞，而另一个细胞亚群则被药物杀死，后者为前者提供了充足的基因资源［23］。
现已在多个肺炎链球菌感受态诱发模型中观察到非感受态细胞亚群被溶解的现象，即异体胞溶(fratricide/sobrinicide)现象［21］。这些被溶解的细胞可能是一些因突变而丧失转化能力的细胞，或是一些仍具有转化能力但却有着不同表型的细胞。异体胞溶现象已被证实有一定生物学意义，是一种战胜其它竞争者以取得生存优势的策略。异体胞溶是感受态亚群采取的一种侵略性反应，通过杀死其它亚群的细胞来获取溶菌后的营养物质，如DNA和氨基酸［24］。同时，感受态细胞也会释放毒力因子和过敏介质来诱发感染，通过活化宿主体内的防御组织来稳定与宿主间的联系，获得暂时的生存优势。异体胞溶和遗传转化的协同作用可能暗示着两者的组合作用会给环境压力下的细菌带来更多的生存优势。
感受态相关基因的研究证实，四个晚期基因(cbpD，lytA，cibA和cibB)的产物与遗传转化作用无关，它们很可能在异体胞溶中起作用［22，24，25］。这些基因被CSP所诱导，分别编码胞壁质水解酶(一种主要的自溶物质)和一种二肽细菌素。胞溶过程涉及到第三种溶菌酶LytC的作用，这种物质并不为CSP诱导的基因所编码。同时，有两种免疫因子被证明用来保护感受态细胞免受裂解［24］。同比枯草芽孢杆菌感受态的研究发现，枯草芽孢杆菌在诱发感受态的同时会启动细胞内生产表面活性剂的反应，这可能也是为了溶解其它细胞，释放其中的DNA和氨基酸以备后续的遗传转化［26］。
4 总结和展望
当细菌面临环境压力时，会采取不同的方式来应对，即针对压力的响应，如当用丝裂霉素C作用于大肠埃希菌时能够诱发SOS反应。但并不是每一种细菌中都存在SOS反应，一些非SOS型细菌如肺炎链球菌在面临生存压力时必须采取其它的响应方式，以保证自身的生长繁殖。现有研究表明肺炎链球菌中感受态可作为SOS反应的替代。抗生素作为一种环境压力，可以在肺炎链球菌中诱发出感受态，为后续的遗传转化做好生理上的准备，并且也能通过诱发异体胞溶作用提供合适的外源DNA片段，为遗传转化做好物质上的准备。
感受态在整体上是被严密控制的，通过在一些最有代表性的物种内研究感受态的调节机制，可以了解这一过程是如何同细胞的整体调节网络联系起来的。尽管对菌体诱发感受态的机制了解得尚不够确切，但是这里所有的数据都能够说明诱发感受态的一个主要目的是通过转化来实现整体的遗传多样化。感受态的诱导对于一些像肺炎链球菌这样的非SOS型菌种来说是十分重要的，因为这可能是这些菌株实现遗传多样化的唯一途径。
然而感受态的研究过程中还存在着许多未能解释清楚的问题，如感受态相关基因中看似“多余”的基因在压力响应的过程中起到了怎样的作用？是否能够诱导感受态的菌种，都同时存在异体胞溶用来获取同源DNA？抗生素诱导感受态的现象在细菌中是否普遍存在……，相信这些问题将会在今后的研究中逐一得到解决。
目前的研究结论告诉我们：抗生素作为环境中的压力，能够诱发细胞转变为感受态。这也许能够从理论上解释一些抗生素滥用后耐药菌频出的原因。不合理地使用抗生素可能诱导细胞高频率出现感受态，提高转化后突变出现的频率，通过抗生素的筛选作用，耐药菌很快占据绝对的生存优势，危害人体健康。这也警示我们必须合理使用抗生素，否则若干年后面对猖狂的耐药菌，人类将陷入无药可用的境地。
作者：齐晓丹 陈代杰《中国抗生素杂志》
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