如何提高抑菌试验速度的探讨

【摘要】  目的 探讨基层检验机构如何进行快速、准确的抑菌试验。方法 用庆大霉素标准药敏纸片对ATCC25922、ATCC25923进行K-B法操作，观察结果分4个试验组和1个对照组，每组操作重复10次，4个试验组分别培养4h，4.5h，5h，5.5h，使用普通光学显微镜放大160倍观察细菌生长情况，根据抑菌圈直径进行初步判断，对照组培养20h肉眼观察，根据抑菌圈直径进行最终判断。结果第4h，4.5h观察的结果与其他各组比较差异有显著性(P<0.05)；第5h，5.5h和20h观察的抑菌直径相比差异无显著性（P>0.05），说明第5h，5.5h的初步判断与第20h的最终判断吻合。结论普通光学显微镜放大160倍观察细菌生长可以加快药敏诊断速度。

【关键词】  抑菌实验；抑菌圈直径；集落计数，微生物；细菌学

　　抑菌试验是诊断细菌和指导临床使用药物以及检验新药药效的重要实验。基层检验机构在无VITEK-32自动检测系统［1］、分光光度计等仪器设备的情况下，如何提高药敏纸片抑菌试验的质量和速度是非常重要的。我们在长期的药敏试验中进行探讨和总结，得出了以下方法，供大家参考。

　　1.1  材料  Muller-hinton Agar（杭州天和微生物试剂有限公司）、ATCC25922、ATCC25923（中国普通微生物保藏管理中心），GEN（庆大霉素纸片，杭州天和微生物试剂有限公司）、MOTIC普通光学显微镜（上海精密仪器仪表有限公司）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  按每1000ml蒸馏水称取Muller-hinton Agar 38g配备M-H琼脂，按每个平皿（直径9cm）25ml进行分装。　

　　1.2.2  将孵育16～24h的ATCC25922、ATCC25923菌落分别接种于生理盐水管中，校正浓度至0.5麦氏标准(相当于1.0×108CFU/ml)［2］。

　　1.2.3  用无菌棉试蘸取菌液，在试管内壁旋转挤去多余菌液后在MH琼脂表面均匀涂布接种3次，每次旋转平板60度，最后沿平板内缘涂抹1周。

　　1.2.4  平板在室温下干燥3～5min后用无菌镊子将GEN纸片紧贴于琼脂表面，置35℃孵育。

　　1.2.5  于第4h，4.5h，5h，5.5h通过普通光学显微镜放大160倍观察，从GEN纸片边缘开始往外观察，以视野由清晰、洁净变为模糊来判断抑菌范围，做出标记后量出抑菌圈直径。第20h肉眼观察量出抑菌圈直径，本次实验每种菌重复10次操作。

　1.2.6  统计学方法  使用F检验和Q检验。

　　2.1  ATCC25922第4h，4.5h，5h，5.5h，20h观察量出抑菌圈直径结果  见表1。

　　2.2  ATCC25923第4h，4.5h，5h，5.5h，20h观察量出抑菌圈直径结果  见表2。

　　表1  ATCC25922不同时间点观察抑菌直径比较（略）

　　经F检验发现有差异后进行Q检验，对多个均数进行两两比较如下：x1=21.26，x2=21.22，x3=21.16，x4=20.82，x5=20.42；Q1（1，2）=0.61，Q2（1，3）=1.54，Q3（1，4）=6.76，Q4（1，5）=12.91，Q5（2，3）=0.92，Q6（2，4）=6.15，Q7（2，5）=12.29，Q8（3，4）=5.22，Q9（3，5）=11.37，Q10（4，5）=6.15；P1>0.05，P2>0.05，P5>0.05，其余均<0.05。

　　表2  ATCC25923不同时间点观察抑菌直径比较（略）

　　经F检验发现有差异后进行Q检验，对多个均数进行两两比较如下x1=22.77，x2=22.69，x3=22.64，x4=22.03，x5=21.42；Q1（1，2）=0.84，Q2（1，3）=1.37，Q3（1，4）=7.8，Q4（1，5）=14.24，Q5（2，3）=0.53，Q6（2，4）=6.96，Q7（2，5）=13.39，Q8（3，4）=6.43，Q9（3，5）=12.86，Q10（4，5）=6.43；P1>0.05，P2>0.05，P5>0.05，其余均<0.05。

根据细菌生长曲线［3］，一般细菌的迟缓期是4h，迟缓期细菌生长缓慢，对数期细菌生长快，虽然第4h观察时还是不能形成肉眼可以看得见的菌落或菌苔，但实际上已经有不少的细菌开始生长，因此抓住迟缓期过后的30min或1h已经有不少的细菌生长的特点使用显微镜放大160倍观察，可以比较清楚区分细菌生长区和抑菌区。GEN纸片吸收水分，药物逐渐扩散引起4～20h的抑菌圈直径逐渐增大，其中4～5h期间抑菌圈直径增大比较多，差异有显著性(P<0.05)，可能是纸片吸收水分不够，药物没有完全释放；5～20h抑菌圈直径增加比较小，差异无显著性(P>0.05)，说明纸片药物已经完全扩散。5h、5.5h、20h观察的抑菌圈直径比较P>0.05，说明第5h观察结果做出的初步诊断与第20h观察的结果做出的最终诊断相同。ATCC25922与ATCC25923的初步诊断结果与最终诊断结果都相同。因此通过显微镜放大观察可以把抑菌试验缩短11h。影响抑菌实验质量的因素很多［4］，比如培养基的质量、药敏纸片的质量、接种菌量、试验操作质量、孵育条件、抑菌圈测量工具的精度和质控菌株本身的药敏特性等均能影响纸片扩散法抗生素敏感试验结果的准确性和精密度。这次实验使用的GEN对ATCC25922、ATCC25923的质控抑菌圈直径范围分别为19～26mm，19～27mm，而得出的实验结果均符合质控值范围，说明本次实验是成功的。综上所述，在条件比较简陋，没有自动检测系统、分光光度计的仪器设备的检验机构通过显微镜放大观察同样可以进行快速抑菌实验，为临床及时做出诊治提供有力的帮助。

 

作者：黄衍强，李晓华，覃艳春，陈源红，秦静英  《右江民族医学院学报》

  　　［1］ 刘文娟，周樱，钱厚明，等.VITEK-32微生物检测系统工作原理及常见故障［J］.医疗装备，2005，(10)：42-43.

　　［2］ 徐淑云，卞如濂，陈修.药理实验方法学［M］.北京：人民卫生出版社，2002.1651.

　　［3］ 周正任，李凡.医学微生物学［M］.北京：人民卫生出版社，2003.20.

［4］ 俞树荣，陈拯，张卓然，等.微生物学与微生物学检验［M］.北京：人民卫生出版社，2001.455.