毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌定量研究

【摘要】  目的：定量研究毛细管区带电泳法（CZE）分离大肠埃希菌（E.coli）以满足临床诊断要求。方法：用毛细管区带电泳法对E.coli ATCC25922进行分离，研究其峰高与E.coli量的关系。结果：毛细管区带电泳法分离E.coli ATCC25922浓度在105cfu/ml～5×107cfu/ml之间线性很好，其峰高与浓度关系符合线性方程：㏑mAU＝﹣5.256＋1.0036×㏑C, R2＝1。结论：CZE法分离大肠埃希菌可进行定量研究。

【关键词】  毛细管区带电泳；分离；大肠埃希菌

    [Abstract]   Objective:A quantitative study about determination of Escherichia coli （E.coli）by capillary zone electrophoresis（CZE） was to meet the clinic diagnosis request. Methods:We determined E.coli ATCC25922 by CZE and studied the linear relationship between the peak height (mAU) and the Escherichia coli concentration (C). Results:The linear relationship of  E.coli ATCC25922 concentration determined by CZE between 105cfu/ml and 5×107cfu/ml was quite good. Regression line equation is ㏑mAU＝﹣5.256＋1.0036×㏑C, R2＝1.Conclusion: Escherichia coli ATCC25922   determined by capillary zone electrophoresis could be used for a quantitative study.

    [Key words]   Capillary zone electrophoresis； Separation； Escherichia coli大肠埃希菌是临床常见感染菌之一，由其引起的泌尿系统感染占53.6%[1]，其诊断主要靠细菌培养法定量分析，但该法耗时较长（通常需2～4天）。毛细管区带电泳是20世纪80年代发展起来的一种高效分离技术，具有快速、灵敏、低耗等优点，可用于研究多种细菌的分离[2]。毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌ATCC25922定量研究，将有利于快速诊断，满足临床要求。

    1   材料和方法

    1.1   仪器   Beckman-Coulet P/ACE MDQ 毛细管电泳仪和 UV检测器, 河北永年锐沣色谱器件公司未涂层石英硅毛细管（内径75μm），上海天达pHS-3TC pH计（0.01级）。

    1.2   试剂和菌株来源   聚氧化乙烯（PEO）、Tris和EDTA(Sigma-Aldrich公司)，硼酸、氢氧化钠、盐酸（上海化剂厂分析纯级），实验用水为双蒸馏水。采用上述材料配制TBE贮存缓冲液（4.5mmol/L TRIS-4.5mmol/L硼酸-0.1mmol/L EDTA，pH8.6），将其1∶16稀释，添加终浓度为0.0125%的PEO(Mn 600000)，并用0.1mmol/L NaOH和盐酸调整pH至9.0，作为电泳缓冲液待用。E.coli ATCC 25922（卫生部临床检验中心）。

    1.3   方法

    1.3.1   电泳方法   采用内径75μm、有效长度（进样端至检测窗口）为40cm的石英毛细管，阳极0.5psi压力进样20s，电压25kV，电泳时间15min，25℃恒温，阴极检测，波长214nm。开机后及每一份标本检测前依次用1.0mol/L氢氧化钠、 双蒸馏水、电泳缓冲液20psi冲洗毛细管5min。

    1.3.2   检测方法   将血琼脂平板上经35℃，18~24h培养的E.coli ATCC 25922的菌落挑于电泳缓冲液中，配成5×107、107、106、5×105和105cfu/ml，静置30min后进行毛细管区带电泳。

    1.4   统计学方法   使用SPSS 11.5 for windows 软件对数据进行统计学分析。

2   结      果

    2.1   CZE分离E.coli定量电泳图   在相同条件下，应用毛细管区带电泳法分离浓度为5×107、107、106、5×105和105cfu/ml的大肠埃希菌,谱峰高度分别为316、61、6.2、2.84和0.62 mAU（毫吸光度），峰形尖锐，分离效率高。电泳图谱见图1。        

    2.2   CZE分离E.coli峰高与浓度的线性关系   根据5次定量试验结果，对大肠埃希菌浓度（C）和相应检测的峰高（mAU）分别取对数，以㏑C为横坐标，㏑mAU为纵坐标，作回归曲线，线性方程为：㏑mAU＝-5.256＋1.0036×㏑C,R2＝1。

    3   讨      论

    细菌为胶体颗粒，比表面积极大，且覆盖着多糖类、肽聚糖、脂类等物质，这些化合物在电泳缓冲液中可因解离和吸附形成双电层；因而，毛细管区带电泳将细菌当作“离子”看待，以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道，在电渗流作用下达到高效聚焦和分离[3，4]。毛细管区带电泳法已成功分离了多种细菌，并取得非常高的分离峰效应（高达10-9表观理论塔板/m）[5]。我们发现大肠埃希菌ATCC25922通常保持较高的存活率，极易聚集出现杂峰，影响分离度。消除聚集可在电泳前使大肠埃希菌与运行缓冲液充分混匀后静置30min以利于缓冲液和添加剂充分与大肠埃希菌作用，形成相对稳定的单个离子减小聚集。

    本研究显示毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌浓度在105～5×107cfu/ml时定量实验敏感性好、分离效率高，峰高与大肠埃希菌浓度的线性关系较好，可依据峰高用回归方程分析大肠埃希菌浓度, 回归方程：㏑mAU＝-5.256＋1.0036×㏑C,R2＝1；对于菌量<105cfu/ml，本试验可将菌液进行10倍浓缩，提高浓度后检测。

随着毛细管区带电泳技术自动化操作的实现，利用其快速、高效、重复性好等优点，为临床快速、批量分离和分析微生物提供了一个很好的选择性手段[6]。尽管毛细管区带电泳法分析微生物还存在着一些亟待解决的问题[7]，但本研究显示经过实验条件的优化，其在微生物的分离和分析中可以得到很好的结果；毛细管区带电泳法分离大肠埃希菌，操作简便、快速、灵敏度高、溶剂消耗少、环境污染小，具有较高的研究价值和前景。

 

   作者：王朔　王惠民，褚少朋，汪桂华 《南通大学学报（医学版）》

  [1] 喻 华,刘 华,颜英俊,等.尿路感染病原菌分布及耐药性检测[J].中华医院感染学杂志,2003，13（10）:983.

[2] 邓延倬，何金兰. 高效毛细管电泳[M].第1版.北京：科学出版社，2000：5.

[3] Jinjian Zheng,Edwardm S Yeung. Mechanism of microbial aggregation during capillary electrophoresis[J]. Anal Chem, 2003,75: 818-824.

[4] Meera J Desai，Daniel W. Armstrong. Separation, identification, and characterization of microorganisms by capillary electrophoresis[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2003, 67（2）:38-51.

[5] Armstrong, DW, Schneiderheinze JM. Rapid identification of the bacterial pathogens responsible for urinary tract infections using direct injection CE[J]. Anal Chem, 2000,72（2）:4474-4476.

[6] 林炳承.毛细管电泳导论[M].第1版. 北京：科学出版社，1996：76.

[7] Armstrong, DW, Girod M, He L, et al. Mechanistic aspects in the generation of apparent ultra-high efficiencies for colloidal (microbial) electrokinetic separations[J]. Anal Chem, 2002,74（3）:5523-5530.