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【摘要】 【目的】 探讨耐氟康唑白念珠菌基因多态性与其耐药性是否相关。【方法】 收集48株敏感白念珠菌和10株耐氟康唑白念珠菌，其中包括2株体外诱导的耐氟康唑白念珠菌。选择1个随机引物（引物1251），采用任意引物PCR方法基因分型，将电泳图谱扫描入计算机后采用Labwork4.0软件转化为数值图表,利用SPSS 11.5进行聚类分析。 【结果】 引物1251的PCR指纹图带型稳定，多态性丰富，可以作为分型引物。聚类分析结果提示8株临床耐药菌的PCR指纹图相似系数为71.7%，而其中7株的耐药菌相似系数高达86.7%，远高于58株菌的平均相似系数(47.3%)。2株体外诱导的耐药菌诱导前后基因型未发生变化。【结论】 基因分型的结果未提示耐氟康唑白念珠菌存在一定的特殊电泳条带，但提示了特定的PCR指纹图可能与耐药性有一定相关性。
【关键词】 白念珠菌； 基因型； 氟康唑； 耐药性，任意引物PCR
Abstract： 【Objectives】 To investigate the possible relationship of C. albicans gene polymorphisms and its fluconazole-resistance. 【Method】 Forty-eight fluconazole-susceptible stains and 10 fluconazole-resistant stains of C. albicans were analyzed, with two resistant stains induced in vitro. All of them were genotyped by arbitrary primed polymerase chain reaction (AP-PCR) fingerprinting employing one interrepeat primes (1251 primers). The image was captured using computer-assisted system with Labwork 4.0 software to analyze the gel patterns of all isolates. The data were processed by SPSS 11.5 statistical software. 【Results】 Primer 1251 was suitable for fingerprinting analysis, and was found to generate the reproducible fingerprinting profiles, yielding well-resolved banding patterns. The AP-PCR profiles of 8 resistant stains isolated clinically were highly similar according to similarity coefficient (71.7%). Furthermore, the similarity coefficient of 7 resistant isolates (86.6%) was significantly higher than that of total 58 stains (47.3%). For two induced isolates, their genotypes did not change much after resistance-inducement in vitro. 【Conclusions】 No specific DNA profiles of C.albicans indicating fluconazole-resistance were identified. However, our results demonstrated a strong genetic correlation between fluconazole-resistant patterns and its AP-PCR profiles in C.albicans.
Key words： C.albicans; genotype; fluconazole; drug resistance; AP-PCR
近年来随着免疫抑制剂、抗肿瘤药物、广谱抗生素的应用及艾滋病流行，临床上因白念珠菌感染所致的深部真菌病逐年增多，而过多、广泛的使用抗真菌药物所产生的选择压力，使念珠菌的耐药现象有明显增多的趋势。白念珠菌的耐药表型与基因型的关系目前仍不清楚，寻找一种恰当的基因分型方法，探讨其与耐药表型的关系，对监测耐药株的分子流行病学，以及深化耐药分子机制的研究有重要的临床意义[1]。我们应用任意引物PCR（Arbitary primed -PCR）的方法对临床分离的白念珠菌进行了基因分型，研究白念珠菌的耐药性与基因多态性的关系。
1 材料与方法
1.1 受试菌株
8株耐氟康唑白念珠菌（MIC>64 μg/mL），分别从近两年我院8名器官移植术后和骨髓移植术后患者的痰液中和深静脉导管黏附物中分离得到。同期选择了47株对氟康唑敏感的白念珠菌，均从我院患者的痰液、血液、静脉导管拭子等分离培养得到。2株为我们利用体外氟康唑诱导后产生耐药性白念珠菌（m90028,m113）另有1株标准的白念珠菌为ATCC90028，为我科实验室保存。
1.2 药物敏感性测定
氟康唑纸片扩散法初筛试验采用2002年美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）认可的酵母菌纸片扩散法敏感试验方法，对58株白念珠菌进行了氟康唑初筛实验。采用Etest法测定耐药菌株对常用抗真菌药的最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration, MIC）。进行MIC测定的菌株为已经氟康唑纸片扩散法测定判为耐药菌株。E test试纸条为瑞典AB.Biodisk公司出品，包括氟康唑(fluconazole) 0.016～256 μg/mL、二性霉素B (amphotericin B) 0.002～32 μg/mL、5-氟胞嘧啶(5-Fu) 0.002～32 μg/mL、酮康唑(ketoconazole) 0.002～32 μg/mL、伊曲康唑(itroconazole) 0.002～32 μg/mL。将5种E test试纸条按不同角度紧贴于培养基上，
1.3 白念珠菌DNA的提取
取保存在牛奶管中的菌种，分别划线转种至沙氏培养基上，
1.4 AP-PCR反应
根据文献[10]选择了1条寡核甘酸引物：引物1251(被称之为真核细胞内重复序列)作为AP-PCR分型的随机引物（由上海生物工程公司合成）,序列为5′－TGG GTG TGT GGG TGT GTG GGT GTG－3′。AP-PCR反应体系：PCR Premix 25 μL（含TaKaRa Taq 1.25 U，dNTPs各0.4 mmol/mL，Mg2+ 3 mmol/mL），白念DNA模板3 μL，Primer F 1 μL（20 μmol/μL），Primer B 1 μL（20 μmol/μL），ddH2O 20 μL，反应终体积50 μL。AP-PCR反应参数如下：
1.5 PCR产物电泳及分析
以DNA分子量100 bp DNA ladder plus marker为分子量标准，PCR产物在含0.5 μg/mL溴乙啶的
2 结 果
2.1 MIC值
表1为10株耐药白念珠菌对5种常用抗真菌药的MIC值。
2.2 PCR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果
8株临床耐氟康唑白念珠菌、2株诱导产生耐药株和48株敏感菌株的DNA模板经引物1251扩增，所得PCR产物电泳带型稳定，得到的DNA多态性丰富，结果明确，对其中30株菌的AP-PCR反应重复3次，获得了较为稳定的PCR指纹图谱（图1-4）。条带数目多在1～9条之间，最小的片段约250 bp,最大的片段约2 200 bp，95%以上的片段集中在500～1 031 bp,90%的菌株有600和800 bp,不同菌株之间的数量和扩增片段的大小存在差异，即使带型完全一致的菌株，有些片段的溴乙啶显色强度也有区别，而通过荧光扫描输入计算机转化为数值图表之后，菌株之间的差异更可以清晰的从数值的大小反应出来。
2.3 不同菌株的基因型之间的关系
聚类分析的结果显示，2株体外诱导的耐氟康唑白念珠菌诱导前后基因型未发生变化，相似系数为100%。而8株临床耐氟康唑白念珠菌的PCR指纹图相似系数为71.7%，其中7株耐药菌的相似系数高达86.6%，而58株菌的平均相似系数为47.3% （图5为58株白念珠菌基因型的聚类树状图）。
3 讨 论
白念珠菌是目前临床上最常见的深部真菌病的病原体，近年来随着高危深部真菌患者的逐年增多，氟康唑在临床上得到广泛使用，其对氟康唑的耐药率也在逐年上升[2,3]。我们收集了我院这3年多出现的8株耐药白念珠菌,另采用体外氟康唑诱导的方法，诱导了2株耐氟康唑白念珠菌。经E-test法检测，10株耐药菌中对氟康唑的MIC值最低为64 μg/mL，最高为256 μg/mL , 有2株出现对5-Fu耐药，4株对酮康唑的MIC值较高，2株出现对酮康唑耐药（MIC=4 μg/mL），3株对伊曲康唑的敏感性较差，MIC值已达1.0 μg/mL，但都对二性霉素-B保持了较好的敏感性。我国目前缺乏对白念珠菌耐药情况的大规模流行病学调查结果，对真菌的耐药机制研究相对较少，迫切需要加强这方面的研究。
目前各种抗真菌药敏试验检测的是白念的耐药表型，如果能在白念珠菌的耐药表型和基因型之间找到某种客观的联系或直接运用基因分型的方法找出引起耐药表型产生的单一多态性，就有可能对与该表型相对应的基因进行定位，从而可以在分子水平对耐药性进行检测，为监测耐药的分子流行病学提供了一种方法，并可以大大加快白念珠菌耐药分子机制的研究。从目前的研究看，碱基突变，片断插入或缺失[4,5]，基因转化，等位基因的缺失都是造成耐药性产生的分子生物学基础[1,6]，这就造成了白念珠菌的基因多态性与耐药性产生的关系。
目前用于基因分型的方法有脉冲电泳技术（PFGE）、限制性内切酶分析与Souther blot杂交、基因芯片等，但这些技术烦琐、费时或昂贵，而AP-PCR是建立在PCR基础上的构建基因组图谱的方法，也称随机引物PCP,由AP-PCR反应产生的指纹图谱的多态性能够用来鉴别亲缘关系很近的个体间的差异。通过选择不与基因组匹配得很好的单个引物及有目的降低退火步骤的严谨度，可重复的获得信息量丰富的基因组指纹图谱,因此能检测近等基因系（或同类系）中的多态性。而且，经过设计可以将序列偏向的人工地加入引物中，使这些引物直接针对重复序列和基元序列，从而扩增出复杂的图谱并可检测多个多态性位点[7]。有学者曾采用RAPD(随机扩增的DNA多态性)进行基因型与耐药性的分析[8]，由于RAPD只采用一个人工合成的不大于10个碱基的短核苷酸链随机引物，极易产生假带而影响辨别。近来，由于计算机辅助分析软件的迅速发展，可以减少由于指纹图谱复杂的带型带来鉴别上的人为误差。Clemons等[9]将电泳结果扫描并用计算机软件进行分析，提出了可以采用相似系数这一统计学概念评价菌株间的亲缘关系。
我们利用AP-PCR的方法，根据文献[10]选择了1条寡核苷酸引物对10株耐氟康唑白念珠菌和48株敏感菌进行了基因分型，经过调整恰当的退火温度和退火步骤，产生的DNA多态性丰富，带型稳定性很好，可作为AP-PCR分型。与文献不同的是，本研究将退火温度降低，并设定了PCR反应首先进行5个低严谨度循环，然后再进行40个高严谨退火条件下的循环，由此产生了比文献更为丰富PCR指纹图。经过计算机荧光扫描指纹图准确的确定了电泳条带的大小，位置，产量大小等，最后将其电泳图像转化为数值图表进行聚类分析，结果发现8株临床耐药菌株的平均相似系数为71.7%，其中7株的相似系数高达86.1%，远高于58株菌的平均相似系数（47.3%）。这提示了耐氟康唑的白念珠菌耐药表型与其基因型可能相关。其中两株体外诱导的耐药株的基因型在该次AP-PCR反应中提示诱导前后基因未发生变化，一种可能是非基因突变的机制导致了耐药性的产生，另一种可能是发生了突变，但该引物未能反映出来。不同菌株即使扩增的产物相同，但同一PCR反应体系的产量之比可有明显不同，这说明不同菌株的等位基因可存在差异，本实验还未能判断耐药菌存在或缺失某一与耐药相关的特殊条带，但不能否定该种基因型的白念珠菌是否易于获得后天的耐药性。8株临床耐氟康唑的白念珠菌的电泳条带并不完全一致，而是表现出较高的多态性，这除与耐药性的产生有多种途径，还与AP-PCR实验也有一定的相关性，如较低的退火温度的产生了非特异的条带，这可以通过重复试验检测纠正，但不适宜大量样品的检测。AP-PCR可以使得基因分型更简单、自动、批量化，但必须要求PCR反应条件标准化，如采用相同的试剂和步骤，同时PCR产物的电泳条件也尽可能保持一致。进一步分析AP-PCR方法产生的DNA特殊标记还需要进行大量的耐药分子流行病学调查数据，由于白念珠菌存在高度的遗传多态性，如果在了解不同白念珠菌基因图谱上设计更为恰当和有针对性的引物，采用精心设计的退火温度，就能准确的识别基因型与耐药性的关系，从而大大加快耐药分子机制的研究。
作者：黄静， 刘慧， 朱家馨， 周宇麒， 谈淑卿， 张天托 《中山大学学报》
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