红曲菌株的分离纯化和鉴定

【摘要】  ［目的］对红腐乳中的红曲菌进行分离纯化和鉴定。［方法］根据红曲菌嗜酸、耐乙醇的生长特性，用含乙醇的麦芽汁、含乳酸的大米培养基分离红腐乳汁中的红曲菌，并用对数稀释平板法进行纯化。纯化后的红曲菌显微观察确定其属别。依照其在MEA培养基上25℃培养的菌落形态特征鉴定到种。［结果］从红腐乳中分离的两个菌株经鉴定M-1属丛毛红曲菌（M.pilosus），M-3属红曲红曲菌（M.anka）。［结论］红腐乳中分离的纯培养为红曲属真菌。

【关键词】  红曲菌；分离；纯化；鉴定

　　Abstract：［Objective］To isolate，purify and identify Monascus strains from red furu.［Method］Based on eosinophilic and ethanol tolerant characteristics of Monascus，stains were isolated from red furu by culturing on malt juice medium containing alcohol and rice medium containing lactic acid.Strains were purified using logarithmic plate dilution method，and then determined genera according to their micro-morphological characteristics.By culturing on malt extract agar medium with temperature of 25 degrees Celsius，strains were identified to species based on the morphological characteristics of colonies.［Result］M-1strain isolated from red furu was identified as Monascus pilosus and M-2 Monascus anka.［Conclusion］Strains isolated from red furn are Monascus fungi.

　　Key words：Monascus；isolation；purification；identification

    红曲菌隶属真菌界（Eumycophyta）子囊菌门（Ascomycota）真子囊菌纲（Euascomycetes）散子囊菌目（Eurotiales）红曲菌科（Monascaceae）红曲属（Monascus）［1］，具有防腐，解毒；消食活血、健脾燥胃之功效［2］。我们根据红曲菌嗜酸、耐乙醇的生长特性［1］，对市售红腐乳中的红曲菌进行分离纯化，并对它们进行了形态学鉴定，为进一步发掘红曲菌生物资源做了有益探索。

　　1.1  实验材料 

　　(1)原料：市售红腐乳、大米、琼脂粉、乙醇、乳酸，麦芽浸出粉（malt extract）。(2)麦芽汁：麦芽浸出粉3g，蒸馏水100ml，PH3.54.0，分装5ml/管，每管加95%乙醇2滴。(3)大米培养基大米10g，蒸馏水15ml，1%乳酸40ul。(4)麦芽汁培养基麦芽浸出粉6g，琼脂粉4g，蒸馏水200ml，PH5.0～6.0。(5)麦芽提取物琼脂（malt extract agar，MEA）培养基麦芽浸出粉2g，蛋白胨0.1g，葡萄糖2g，琼脂粉1.5g，蒸馏水100ml，PH6.0。

　　1.2  方法

　　1.2.1  分离 

　　无菌条件下，红腐乳汁经2层纱布过滤，取0.1ml滤液于5ml麦芽汁，一式3管，空白对照1管。32℃培养，观察。挑取麦芽汁上长出的红色菌体少许，置于大米培养基中，一式3皿，空白对照1皿。32℃培养，观察。

　　1.2.2  纯化 

　　从大米培养基上挑取红色菌体少许于1ml无菌生理盐水（NS）中，用对数稀释平板法［3，4］获得纯培养。

　　1.2.3  鉴定 

　　取纯化后的红曲菌种，点种到MEA培养基32℃培养成熟。在载玻片上滴加一滴蒸馏水，用解剖针挑取少许菌丝，用50％乙醇浸润，再用蒸馏水清洗一下，然后放入载玻片上的液滴中，仔细地用解剖针将菌丝分散开来，盖上盖玻片(勿使产生气泡，且不要再移动盖玻片)，制成水浸标本片，用显微镜观察。取纯化后的红曲菌种，点种到MEA培养基25℃培养，观察红曲菌落大小、形态、色泽，气生菌丝的产生情况。

　　2.1  分离 

　　接种红腐乳汁的麦芽汁在3～4d后可见白色团状菌丝，7d后菌丝转为红色，培养液亦呈红色，而CK管中始终无菌体生长。3d后，接种分离菌的大米培养基上有微量无色菌体生长，6d后菌落明显，呈白色，7d后菌落长大，粉红色，8d后菌落更大，红色。

　　2.2  纯化 

　　将来自大米培养基的真菌稀释液涂布于麦芽汁平板培养后发现菌体生长良好、无杂菌，并出现明显的单菌落，编号为M-1～M-3……。

　　2.3  形态学鉴定 

　　显微镜观察所分离的菌丝具不规则分枝，多核，有横隔，含油滴，透亮或有深浅不一的红、褐色色素，分生孢子着生在菌丝及其分枝的顶端，孢子单生或链状，闭囊壳球形，有柄（图1）。

    纯化后的M-1菌株点种到MEA培养基，25℃培养，初期为圆形白色小菌落，7d后菌落圆形，直径28mm，米色，气生菌丝丛毛状，菌落背面红色，有放射状条纹（图2）。

    纯化后的M-3菌株接种到MEA培养基，25℃培养，菌落初期为圆形，白色，7d后菌落直径8mm，铁锈色，中间裂开，边缘较整齐，质地致密；25d后，菌落直径22mm，深锈色，中间隆起，裂开，边缘有缺刻，无气生菌丝，菌落背面深赭色，有放射状条纹（图2）。

红腐乳汁接种到含乙醇的麦芽汁中长出的菌产红色色素、菌丝致密、成团生长，初步判断为红曲菌，再用含乳酸的大米培养基筛选祛除杂菌。这与红曲菌的生态习性有关，同时也证实了在PH2.5和高达10%乙醇的培养条件下一般只有红曲菌才能生长。将分离菌株的显微形态特征与红曲菌(Monascus)的属征［1］相对比，两者基本吻合，进一步证实我们所分离的纯培养M-1、M-3确为红曲属真菌。将纯化后的分离菌株点种到MEA培养基，25℃培养，观察其菌落生长形态特征，对照李钟庆等的红曲菌属分类检索表［1］，将M-1菌株鉴定为丛毛红曲菌（Monascus.pilosus），M-3菌株鉴定为红曲红曲菌（Monascus.anka）。这不仅丰富了红曲菌种库，而且为进一步发掘红曲菌生物资源奠定基础。

 

 作者：丁红梅  《浙江中医药大学学报》

  　　［1］李钟庆，郭芳.红曲菌的形态与分类学［M］.北京：中国轻工业出版社，2003：2，11，3-6，45-48.

［2］李时珍.本草纲目［M］.重庆：重庆出版社，20006：390.

［3］毛瑞丰，黄丽，仁绍坤.红曲米中红曲霉的分纯及抗菌作用的研究［J］.广西大学学报(自然科学版)，2006，31（4）：319-321.