【摘要】 目的： 建立一种更加稳定、高效的肺炎链球菌实验室转化模型，以便于对该菌的各种目的基因进行重组改造. 方法： 分别用改进方法和既往方法制备肺炎链球菌感受态细胞，转化外源DNA，获取发生了转化的菌株，通过抗生素培养基培养和PCR鉴定是否发生转化；并计数抗生素筛选平板上的转化菌落，比较两者的转化率，以确定更佳的转化模型. 结果： 肺炎链球菌334菌株、31203菌株用改进方法的转化率分别为（0.89±0.20）％，（0.71±0.10）％，高于既往方法的转化率［分别为(6.2±1.4)×10-3％，(5.7±1.1)×10-3 ％］，构建了肺炎链球菌感受态缺陷菌株，建立了改进的肺炎链球菌实验室转化模型. 结论： 改进的转化模型实现了稳定的肺炎链球菌实验室转化，能方便研究者对该菌进行各种遗传操作，为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.
【关键词】 肺炎链球菌；转化，细菌；感受态
【Abstract】 AIM: To establish a transformation model of Streptococcus pneumoniae(S.pn) in laboratory to promote the transformation efficiency and reconstruct its chromosome gene by improving the previous transformation method. METHODS: The competence cells of S.pn were prepared using both the previous and improved methods. After the exotic DNA was transformed under certain cell density, the transformed colonies on antibiotic plate, which was identified by growing in antibiotics culture and PCR, were counted to compare their transformation rate. RESULTS: The improved transformation model of S.pn in laboratory was established. The transformation rate of S.pn 334 was （0.89±0.20）％ and S.pn 31203 was （0.71±0.10）％ under the improved transformation model, which was relatively higher. Using this model, we constructed 4 S.pn competencedefective strains. CONCLUSION: In laboratory, the improved transformation model can raise the transformation rate of S.pn, which induces different S.pn into competence, and provides a research technology for further investigation on pneumococcal pathogenesis.
【Keywords】 occus pneumoniae; transformation, bacterial; competence
0 引言
转化是指细菌在自然生长状态下可自发形成感受态（特指细菌能够摄取外来游离DNA的一种状态），摄取外源性DNA，通过同源重组导致基因发生改变的过程. 通过转化可以改造细菌基因，进行功能基因组研究，它是研究肺炎链球菌（S.pn）生物学功能的重要手段. 本课题组既往的S.pn实验室转化模型［1］有两大弊端：一是转化效率不稳定；二是感受态开放时间较短，不能满足大规模转化的需要. 有研究［2］认为冷刺激可能会延长感受态开放时间，我们据此对既往转化模型进行改良，即冷冻处理细胞后再做转化，以期克服其弊端.
1 材料和方法
1.1 材料 S.pn血清4型标准菌株TIGR4(ATCCBAA334)，干粉（美国ATCC微生物菌种保存中心）；S.pn血清3型标准菌株CMCC(B)31203，干粉（中国药品生物制品检定所医学微生物菌种保存中心）；SⅡ型S.pn(1和2号菌株)由中国医科院提供；主要遗传特征经鉴定合格. C+Y培养基：含5 g/L Yeast提取物（Lacks and Hotchkiss, 1960）；TSA 血平板：含50 mL/L兔脱纤维全血. 感受态刺激因子（CSP2）由挪威生命科学大学Havarstein LS教授惠赠；S.pn CP1250的染色体DNA（含有链霉素抗性基因str）由美国Morrison教授惠赠；S.pn 1d菌株的基因组DNA(含红霉素抗性基因erm 的comE断裂基因)由本课题组构建［3］；DNA提取试剂盒（上海华舜公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；胰蛋白胨、大豆蛋白胨（Gibco公司）. 722分光光度仪（上海仪器分析三厂）；-80℃低温冰箱（日本SANYO Medical freezer MDF330型）.
1.2 方法
1.2.1 S.pn的生长曲线绘制 挑取S.pn单个菌落接种于C+Y培养基，37℃培养12 h，转接于20 mL C+Y培养基中，于37℃水浴孵育，从1 h后开始在分光光度仪上测菌液A620 nm值，之后每隔1 h取样1次. 以时间为横坐标，吸光度为纵坐标绘制细菌的生长曲线.
1.2.2 改进的S.pn实验室转化模型的建立
1.2.2.1 改进的S.pn实验室转化模型 取冻存于-80℃冰箱的S.pn菌株，培养于CTM培养基（含C+Y培养基，1 mmol/L CaCl2，0.1 g/L BSA）中，37℃水浴至A550 nm＝0.1左右时，将甘油加入上述菌液中，至其终浓度为100 mL/L，分装后冻于-80℃，此即为S.pn感受态细胞；24 h后取出冻存菌液，在冰上融化，9000 g离心1 min，弃去上清液，加入100 μL C+Y培养基（pH8.0），使沉淀彻底悬浮，加入CSP20 μg/L，同时加入S.pn CP1250的染色体DNA 100 μg/L，于37℃孵育90 min，铺于含200 mg/L链霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培养24～48 h，即得到转化菌落.
1.2.2.2 方法学比较 取冻存于-80℃冰箱的S.pn菌株，分别用上述改进方法和既往方法［1］制备S.pn感受态细胞，然后加入CSP2 20 μg/L，并加入S.pn CP1250的染色体DNA100 μg/L，于37℃孵育90 min，铺于含200 mg/L链霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培养24～48 h，计数抗生素血平板上的转化菌落. 转化率=平板菌落数/细菌总数×100%. 其中，细菌总数按A620 nm=0.6时， 细菌数为5 × 1011 cfu／L计算.
1.2.3 S.pn感受态缺陷菌株的制备及鉴定
1.2.3.1 感受态缺陷菌株的制备 用上述改进的转化方法制备S.pn感受态细胞，然后加入CSP2 20 μg/L，及含comE断裂基因的染色体DNA（即S.pn 1d菌株DNA）100 μg/L，于37℃孵育90 min，铺于含0.25 mg/L红霉素的TSA血平板上，于37℃孵箱培养24～48 h，挑取平板上的转化菌落，接种于含0.25 mg/L红霉素的C+Y培养基中，37℃培养增菌，当菌密度为A620 nm=0.2左右时，冻于－80℃冰箱保存，即得到缺陷菌.
1.2.3.2 感受态缺陷菌株的鉴定 鉴定1：将野生菌和缺陷菌同时做转化，选用CP1250的DNA为外源基因. 鉴定2：提取野生菌和缺陷菌的染色体DNA，用comE（5′TGCTCAGTCAATTGTCTATGCTCG3′，5′ACCAACGGACCTTCTATCTGTAGC3′）和erm（5′CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT3′， 5′AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT3′）的引物［4］做PCR. 加入comE或erm的上、下游引物5 μmol/L，加入MgCl2 2.5 μmol/L，Taq plus DNA聚合酶1 U. 循环参数为95℃ 5 min预变性；94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 30个循环；72℃ 10 min. 15 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定.
统计学处理：根据资料类型采用t检验，以P<0.05为差别有统计学意义(双侧).
2 结果
2.1 S.pn的生长曲线 S.pn菌株334和31203的生长曲线无明显差别，生长情况基本一致（图1）.
图1 肺炎链球菌334和31203菌株的生长曲线（略）
2.2 改进的S.pn实验室转化模型 获得S.pn 334和31203菌株的转化菌株，转化率分别为1.03％和0.82％. 方法学比较实验结果显示，S.pn菌株334和31203用改进转化模型后，两株细菌的转化率皆比用既往转化模型的转化率高两个数量级，差异有统计学意义（P<0.05，表1），改进转化模型的转化效率明显优于既往转化模型.
表1 肺炎链球菌（S.pn）334和31203菌株用不同转化模型的转化率比较（略）
aP<0.05 vs 既往方法.
2.3 S.pn感受态缺陷菌株的获得 利用含comE断裂基因的染色体DNA转化S.pn 334，31203，1和2号菌，分别得到转化菌落，即为S.pn感受态缺陷菌，转化率分别为0.90％，0.75％，6.80％和9.40％. 鉴定1：将野生菌和缺陷菌同时转化抗链霉素(str)的DNA，野生菌获得转化菌株，而缺陷菌无一个菌落生长. 鉴定2：以野生菌和缺陷菌的染色体DNA为模板，以comE和erm的引物做PCR，缺陷菌分别在1515 bp和726 bp处有产物，而野生菌则无这两个片段的产物（图2）.
M： 2000 bp ladder DNA maker；1～4：获得的S.pn 334，31203，1，2号菌株的感受态缺陷菌DNA含有erm基因；5～8：获得的S.pn 334，31203，1，2号菌株的感受态缺陷菌DNA含有com E断裂基因.
图2 肺炎链球菌感受态缺陷菌株（略）
3 讨论
S.pn是自然界可以发生自然转化的一种条件致病菌，在目前发现的可以发生自然转化的几种细菌中，S.pn的转化率最高［5］. 转化后可发生基因同源重组，因而还是基因敲出、基因突变的有利工具，对于细菌功能学的研究很有帮助，因此我们需要掌握S.pn在实验室的稳定、高效的转化模型，以便于对其基因功能以及致病机制进行深入研究. S.pn的转化受密度感应系统的控制，当细菌生长到一定密度时，感受态会受到抑制，自然状态下，S.pn感受态开放时间仅十几分钟，所以很难在实验室条件下捕捉到S.pn的自然转化. 人工纯化合成的CSP能诱导S.pn转化，使S.pn在实验室转化成为现实. 然而既往的转化模型不够稳定，且不适合大量连续的实验室转化，有待改进. S.pn的荚膜较厚，会妨碍外源DNA的转入，冷冻处理可能会减弱S.pn荚膜的形成，使其转化率增加［6］，且有研究认为冷刺激会延长细菌感受态开放时间，因此我们在细菌自然生长合适的菌密度时（许多研究认为此时S.pn处于自然转化期）冷冻S.pn感受态细胞，然后利用CSP进一步诱导S.pn转化.
本课题组的前期实验［1］已摸索出适合S.pn31203的转化培养基、pH及培养时间（菌密度）等，我们通过绘制31203菌株和334菌株的生长曲线，发现两者的生长情况基本一致，因此对334菌株采用相同的转化体系和条件. 我们的结果显示，在实验室条件下，运用选定的转化体系和条件，能将外源DNA转入细菌，且改变了细菌的生物学性状，使其产生了抗生素抗性，成功地建立了改进的S.pn实验室转化模型. 两种菌株采用改进的转化模型后，其转化率均明显高于既往转化模型，说明冷冻处理感受态细胞能有效提高其转化率；且改进模型可以一次制备大量S.pn感受态细胞，操作简便，可连续使用感受态细胞. 因此改进的S.pn实验室转化模型相当稳定、高效.
comE是调控S.pn感受态的关键基因，各种环境因素对S.pn转化发生的调节都是通过直接或间接方式影响comE的表达来实现的［7-8］. 我们选用该基因为目的基因，将含comE断裂基因的DNA转入野生菌，得到感受态缺陷菌株，实验证明这些缺陷菌的确不能发生转化，可用于下一步相关研究. 说明可以通过稳定的实验室转化模型，改造那些具有自然转化特性的细菌（如S.pn）的各种基因，进而观察细菌发生的变化. 采用这种模型方便了对细菌进行各种遗传操作，为深入研究其致病的分子机制提供了一个技术平台.
作者：赵清，李南，张雪梅，胥文春，朱兴华，张群，尹一兵《第四军医大学学报》
【参考文献】
［1］ 孟江萍，尹一兵，张雪梅，等. 肺炎链球菌转化模型的建立与优化［J］. 微生物学杂志，2006，26（1）：10-13.
［2］ Whatmore AM, Barcus VA, Dowson CG. Genetic diversity of the streptococcal competence (com) gene locus ［J］. J Bactefiol，1999, 181(10):3144-3154.
［3］ Zhang XM, Yin YB, Zhu D, et al. The Effect of Transformation on the Virulence of Streptococcus pneumoniae［J］. J Microbiol, 2005, 43(4): 337-344.
［4］ Lee MS, Morrison DA. Identification of a new regulator in streptococcus pneumoniae linking quorum sensing to competence for genetic transformation ［J］. J Bacteriol, 1999, 181(16): 5004-5016.
［5］ Cvitkovitch DG. Genetic competence and transformation in oral streptococci［J］. Crit Rev Oral Biol Med, 2001, 12(3): 217-243.
［6］ Joann H, William EA, Jeffrey A, et al. Genome of the Bacterium Streptococcus pneumoniae Strain R6 ［J］. J Bacteriol, 2001, 183(19):5709-5717.
［7］ Echenique JR, Trombe MC. Competence modulation by the NADH oxidase of Streptococcus pneumoniae involves signal transduction ［J］. J Bactefiol，2001，183(2)：768-772.
［8］ Guiral S, Henard V, Granadel C, et al. Inhibition of competence development in Streptococcus pneumoniae by increased basallevel expression of the ComDE twocomponent regulatory system［J］. Microbiology, 2006, 152:323-331.
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