【摘要】 目的探讨菌群失调对机体免疫细胞和细胞因子的影响。方法用卡那霉素制作小鼠肠道菌群失调的动物摸型，进行肠道菌群的定量分析，同时进行免疫细胞和细胞因子相关指标的测定。结果实验组小鼠肠道内菌群数量明显低于对照组（P<0.01）。菌群失调后实验组小鼠较对照组脾细胞数、脾抗体形成细胞数减少，脾重量减轻（P<0.05或P<0.01）；实验组小鼠血清白细胞介素-2（IL2）和粒巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）的含量较对照组低（P<0.01）。结论肠道菌群失调可减少机体的免疫细胞及降低细胞因子。
【关键词】 小鼠；菌群失调；免疫细胞；细胞因子
人和动物体内存在大量有益菌，这些菌不但对机体无毒、无害，而且参与宿主的消化、营养、代谢、吸收、免疫及抗感染的过程。大量研究证明，它在维持机体健康的微生态平衡中起着重要的作用。我们应用抗生素脱污染使小鼠肠道菌群失调，然后观察对机体免疫细胞及细胞因子的影响。
1 材料和方法
1.1 实验动物
纯系BALB/C小鼠80只，8周龄，体重18～22 g，雌雄各半，由河北医科大学实验动物学部提供。
1.2 实验材料
卡那霉素由中国药品生物制品鉴定所提供; 非选择性培养基和选择性培养基EMB、EC、BS、LBS（分别培养肠杆菌、肠球菌、双歧杆菌、乳杆菌）均由天津金章医用新技术研究所提供；豚鼠补体由本实验室制备。
1.3 实验方法
1.3.1 动物模型制备［1］
将实验动物随机抽取实验组和对照组，每组10只。实验组小鼠卡那霉素50 mg（稀释量为0.4 ml）灌胃，每天上午1次，连续10 d；对照组小鼠蒸馏水0.4 ml灌胃，方法及天数同实验组。所有小鼠10 d后采取摘眼球放眶血方法处死，盲肠内容物用于肠道菌群的培养，验证动物模型是否准确建立。
1.3.2 小鼠肠道菌群和脾重量的检测
实验组和对照组小鼠各10只,按上述方法制作动物模型,然后放眶血处死。取盲肠内容物0.1 g，置于放有玻璃球的小瓶中，加入0.9 ml无菌生理盐水，加盖，200 r/min在振荡器上振荡15 min，均质化的标本稀释度为10-1，从此混合液中吸取0.2 ml，再加1.8 ml无菌生理盐水，混匀，此标本稀释度为10-2，继续进行10倍稀释至10-8。采用Mile与Misra所介绍的方法接种，每个稀释度定量接种3个液滴。选择适当的计算菌落的稀释度进行菌落计算。结果以Log的菌落形成单位/克(CFU/g)表示。小鼠处死后用75％酒精浸泡2 min，取出后固定在蜡盘上，解剖腹腔，将脾脏与周围组织分离取出，用滤纸吸除黏附的血液后，称重。
1.3.3 脾抗体形成细胞(PFC)测定
实验组和对照组各10只小鼠，每日每只50 mg卡那霉素灌服。服药3 d后，同时用绵羊红细胞（SRBC）免疫，5% SRBC腹腔注射0.4 ml，连续免疫4 d，再喂药7 d后，断颈处死小鼠，取出脾脏。将小鼠脾脏用100目钢网和注射器芯研磨制成单个脾细胞悬液，用Hank液洗两遍，1 000 r/min，离心15 min，每个脾细胞加6 ml Hank液混匀。取24孔板，每孔加180 μl Hank液，50 μl 1∶3稀释的豚鼠补体，50 μl 10％SRBC，20 μl脾细胞，混匀，填充小室，蜡封小室边缘，37℃ 1.5 h温箱孵育，计数小室内空斑数量。
1.3.4 白细胞介素(IL)2和粒巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)测定
实验组和对照组各10只小鼠,模型建立和免疫同上,小鼠摘眼球处死，取眼眶静脉血于试管中，静置1 h后，离心，取血清。采用双抗体夹心ELISA法分别按照试剂盒说明进行检测。待测血清中的IL2、GMCSF与包被抗小鼠IL2、GMCSF单抗体结合，加入酶标抗体后形成复合物，后者与底物作用呈现显色反应，429 nm处测OD值，IL2、GMCSF浓度与OD值成正比。检测程序：①建立标准曲线；②加样：待测品孔每孔各加入待测样品100 μl；③将反应板充分混匀后置37℃,120 min；④洗板：用洗涤液将反应板充分洗涤4～6次，滤纸上印干；⑤每孔中加入第一抗体液50 μl，将反应板置37℃,60 min，洗板同前；⑥每孔加酶标抗体工作液100 μl，将反应板置37℃,60 min，洗板同前；⑦每孔加底物工作液100 μl，置37℃暗处反应5～10 min，每孔加入1滴终止液混匀；⑧在429 nm处测吸光度值；⑨在半对数纸上画出标准曲线，根据样品的A值在曲线上查出相应的IL2、GMCSF含量。
2 结果
2.1
肠道正常菌群 见表1。 表1肠道正常菌群的测定结果
2.2脾脏相关指标见表2。 表2脾脏相关指标的测定结果见表3。表3细胞因子的测定结果
3 讨论
正常情况下，人体肠道内菌群与宿主间存在着相互依赖、相互制约的微生态平衡［2］，这种平衡的破坏，会对机体的许多生理功能造成影响，如免疫功能和造血功能等。抗生素能对微生态平衡造成破坏已被学界所关注。本实验采用给小鼠灌服卡那霉素10 d后，经检测发现，小鼠肠道双歧杆菌、乳杆菌、肠球菌、肠杆菌的数量减少，此发现进一步说明抗生素可破坏肠道的微生态平衡，造成肠道菌群紊乱。脾脏是各类免疫细胞聚集的器官，也是对抗原物质产生免疫应答及免疫效应物质（如抗体等）的重要器官。研究发现，菌群失调或正常菌群数量的减少会使宿主的脾细胞增殖功能及IL1和IL2的活性明显降低［3，4］。本实验发现，菌群失调后会使小鼠脾脏重量减轻，脾细胞数和脾抗体形成细胞数减少，脾细胞内IL2的含量降低，结果提示由于缺乏正常菌群作为免疫原性物质刺激，影响了脾脏的正常发育，使脾脏萎缩和脾细胞功能低下，从而不但降低机体的特异性免疫功能，同时由于IL2的含量的减少，还会降低非特异性免疫功能。Simon等［5］研究发现菌群失调会影响骨髓循环干细胞的数量，GMCSF是造血细胞因子家族的成员，主要由T淋巴细胞在抗原或丝裂原刺激下产生。本研究发现菌群失调后GMCSF的含量较正常小鼠减少，造成机体造血功能降低。从另一方面反映出正常菌群可刺激机体的造血功能，刺激造血细胞因子GMCSF的分泌。在人肠道正常菌群中大约有400多种细菌［6］，双歧杆菌、乳杆菌、肠杆菌和肠球菌等是优势菌群。我们通过给小鼠抗生素灌胃，观察了机体肠道菌群的变化，同时观察了菌群失调后对机体免疫细胞及细胞因子的影响，结果提示抗生素可造成肠道正常菌群的失调，并且菌群失调后可对机体免疫细胞和细胞因子产生明显影响，为研究机体免疫功能和造血功能提供了理论基础，也提示临床医生要合理使用抗生素等，以减少菌群失调对机体产生的不良影响。
作者：张亚超 王沛 张玉玲 孙晓丽 刘颖 王仁杰 《白求恩军医学院学报》
【参考文献】
1 康白.正常菌群检测法.见：范明远，主编.康白论文集.第1版.北京微生态学杂志编辑部.1989.101110.
2 康白.微生态学原理.大连:大连出版社,2002.1.
3 Nicaise P， Gleizes A，Sandre C，et al.Modulation of aspecific humoral immune response and changes in intestinal flora mediated through femented milk intake.FEMS Immunol Med Microbiol，1998,48（6）:585595.
4 孙延波,盛学成. 脱污染小鼠免疫功能的实验研究.中国微生态学杂志，1995,7(2):13.
5 Simon D，Henk G，Froukje de B，et al.Influence of high versus low intestinal concentration of Gramnegative bacteria and Endotoxin on the susceptibility of murine myelopoiesis in bone marrow and spleen to cytostatic treatment with AraC. Leuk Research,1992,16(10):985991.
6 康白.微生态学正在迅猛发展.中国微生态学杂志，1995，7（4）：1.
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