【摘要】 目的了解昆明市第一人民医院临床分离的大肠埃希菌超广谱β内酰胺酶(extended spectrum βlactamases，ESBLs)的耐药表型和水平传播情况。方法 对2005年1月～12月昆明市第一人民医院临床分离的197株大肠埃希菌用表型确证试验检测ESBLs，用KirbyBauer琼脂扩散法做药物敏感试验；用接合试验了解产ESBLs基因是否定位于质粒，并对接合子进行KB法药敏试验和ESBLs表型确证。结果 197株大肠埃希菌中共检出产ESBLs菌104株，检出率52.79%。在各类标本中产ESBLs菌株在纤维支气管镜(bronchofibroscope，BF)刷片中分离率最高(75%)，就科别来看内分泌科标本的产ESBLs大肠埃希菌的分离率最高(78.57%)。除亚胺培南和阿米卡星外，产ESBLs菌株对其他15种抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBLs菌株(P<0.01)。104株产ESBLs菌株中有91株符合供体菌的标准，64株接合成功，接合子均确证产ESBLs，其接合率为70.33%。64株供体菌及其相应接合子的药敏结果显示除复方磺胺甲口恶唑、左氧氟沙星、庆大霉素、头孢吡肟和头孢西丁外，供体菌及其接合子对其他12种药物耐药率无显著性差异(P>0.05)。结论 昆明市第一人民医院大肠埃希菌产ESBLs和耐药质粒水平传播情况严重，临床应加强对大肠埃希菌耐药性的监测，严格掌握抗生素的使用指征，防止耐药菌株的传播流行。
【关键词】 大肠埃希菌；超广谱β内酰胺酶； 耐药； 接合实验
大肠埃希菌是临床分离的革兰阴性杆菌中最常见的菌种，它作为重要的条件致病菌广泛存在于自然界，由于临床广谱抗生素特别是第三代头孢菌素抗生素的大量使用，菌类在选择性压力下不断发展其耐药机制，产生超广谱β内酰胺酶已成为重要的耐药机制之一，给临床治疗带来很大的困难。本研究收集2005年1月～12月我院临床标本中分离的197株大肠埃希菌，通过表型确证试验、药物敏感试验和接合试验，了解本地区大肠埃希菌产ESBLs发生率、产ESBLs菌株的药敏情况以及产ESBLs大肠埃希菌耐药性在同种菌中的水平传播情况，现报道如下。
1 材料和方法
1.1 菌株及鉴定
收集2005年1月～12月昆明市第一人民医院住院及门诊感染患者送检的各类标本中分离得到的大肠埃希菌197株，排除同一患者同一部位重复分离的菌株。其中来自尿液标本96株(48.73%)、痰液标本68株(34.51%)、血液标本11株(5.58%)、BF刷片8株(4.06%)、伤口分泌物5株(2.54%)、脓液3株(1.53%)、其它标本6株(3.05%)。标本来自呼吸科40例、门诊29例、消化内科18例、重症监护室(ICU)17例、内分泌科14例、泌尿外科14例、干部科12例、肿瘤科11例、中医科9例、神经外科8例、儿科6例、神经内科4例、骨科2例、其他科室13例。全部菌株按照《全国临床检验操作规程》第二版常规培养分离。菌株采用BD BBL Crystal ENF鉴定系统鉴定到种。
1.2 质控菌株及受体菌
质控菌为大肠埃希菌ATCC35922(敏感株)和大肠埃希菌ATCC35218(产β内酰胺酶株)。受体菌为利福平耐药的大肠埃希菌C600(北京协和医院检验科惠赠)。
1.3 培养基、抗菌药物纸片和试验用药
法国BioMerieux公司MuellerHinton琼脂；英国Oxoid生产的药敏纸片， 分别为阿米卡星、 阿莫西林/克拉维酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、复方磺胺甲口恶唑、左氧氟沙星、哌拉西林、庆大霉素、亚胺培南、头孢吡肟、头孢呋辛、头孢曲松、头孢噻肟、头孢他啶、头孢西丁、头孢唑林、头孢噻肟/克拉维酸(CD03，30μg/10μg)、头孢他啶/克拉维酸(CD02，30μg/10μg)，共19种。利福平(美国Sigma公司)、头孢噻肟(德国Hoechst公司)。
1.4 药物敏感试验
采用KB纸片扩散法，药敏结果均按照美国CLSI/NCCLS 2003年标准定义，以敏感(S)、中介(I)、耐药(R)报告结果。
1.5 ESBLs确证试验
参照CLSI/NCCLS M2A8(2003年版本)推荐的纸片确证扩散法标准进行，采用头孢噻肟(30μg)，头孢噻肟/克拉维酸(30μg/10μg)，头孢他啶(30μg)，头孢他啶/克拉维酸(30μg/10μg)纸片检测，对两组中任何一个药物加克拉维酸的抑菌圈直径与不加克拉维酸的抑菌圈直径相比，差值≥5mm时，可确证该菌株产ESBLs。
1.6 接合实验
利用分别含利福平、头孢噻肟抗生素的MH平皿筛选供体菌共91株，受体菌为利福平耐药的大肠埃希菌C600，接合完成后，用含有3mg/L头孢噻肟和150mg/L利福平的MH平皿筛选接合子。筛选出的接合子作生化鉴定与大肠埃希菌C600生化特征一致，对接合子进行KB法药敏试验和ESBLs表型确证。
1.7 结果分析
文中的数据和表格采用WHONET5.3软件及Excell进行分析。耐药率比较采用SPSS11.0软件进行χ2检验。
2 结果
2.1 ESBLs分离率
2005年1月～12月临床分离的大肠埃希菌共197株，其中104株产ESBLs，ESBLs分离率为52.79%。
(1)产ESBLs菌株在不同标本中的分布 大肠埃希菌在中段尿标本中的分离株数最多(96株)，其次是痰(68株)和血液(11株)标本；产ESBLs株分别为47株(49%)、40株(58.8%)和3株(27.3%)。在BF刷片中分离率最高［8株中产ESBLs 6株(分离率75%)］，其次为脓液［3株中产ESBLs 2株(66.7%)］和伤口分泌物［5株产ESBLs 3株(6%)］。
(2)产ESBLs菌株在不同病区的分布 大肠埃希菌在呼吸科的分离株数最多(40株，其中产ESBLs 20株)，其次为门诊(29株，产ESBLs 13株)和内分泌病房(14株，产ESBLs 11株)。内分泌科产ESBLs大肠埃希菌的发生率最高，其次为神经外科和干部病房。
(3)产ESBLs菌株与非产ESBLs菌株耐药率比较 两种菌株除对亚胺培南和阿米卡星耐药率的差异无统计学意义(其中两者对亚胺培南的敏感率均为100%)外，产ESBLs菌株对其他15种抗菌药物的耐药率明显高于非产ESBLs菌株(P<0.01)，其中非产ESBLs菌株对头孢曲松、头孢他啶、氨曲南和头孢吡肟的敏感率为100%，产ESBLs菌株对四种药物的敏感率只有15.4%～84.6%。ESBLs阳性菌株与ESBLs阴性菌株对17种抗菌药物的耐药率比较如表1所示。 表1 产ESBLs菌与非产ESBLs菌耐药率比较
2.2 接合实验
104株产ESBLs菌株中有91株对利福平敏感并对其做接合试验，结果有64株接合成功，接合子的生化特征与受体菌大肠埃希菌C600完全一致，64株接合子均确证产ESBLs，其接合率为70.33%。64株供体菌及其相应接合子的药敏结果显示除复方磺胺甲口恶唑、左氧氟沙星、庆大霉素、头孢吡肟和头孢西丁外，供体菌及其接合子对其他12种药物耐药率的差异无统计学意义(P>0.05)，两者对氨苄西林、哌拉西林、头孢唑林和头孢呋辛的耐药率均为100%，对亚胺培南的敏感率均为100%。
3 讨论
在美国，肠杆菌科细菌ESBLs的平均检出率为3%，不同医院的检出率波动在0～25%；埃及肠杆菌科细菌ESBLs的发生率达到60.9%；土耳其大肠埃希菌的ESBLs发生率为12%［1，2。在中国大陆，不同医院之间有明显差异，如上海2000年4家医院联合监测结果显示大肠埃希菌中的ESBLs发生率为30.21%［3］；王辉等对2003～2004年中国10家教学医院革兰阴性杆菌的耐药分析结果显示大肠埃希菌ESBLs发生率为56.8%［4］；2002年浙江省大肠埃希菌中的ESBLs发生率为36.3%［5］；2002年广东大肠埃希菌中的ESBLs发生率为28.1%［6］。同一医院不同时期ESBLs的发生率也有差别，如复旦大学附属上海市第五人民医院从1999～2002年大肠埃希菌中的ESBLs发生率分别为21.5%、17.7%、22.6%和32.4%，有逐年升高的趋势［7］；我院2002年、2003年、2004年1～6月大肠埃希菌ESBLs发生率分别为37.1%、45.8%和66.2%［8］，本研究结果示2005年1月～12月我院大肠埃希菌ESBLs发生率为52.79%，较2004年1～6月有所下降，可能与我院加强ESBLs的监测和合理使用第三代头孢菌素有一定的关系，但ESBLs发生率仍处于较高水平，因此临床上应继续严格掌握和使用第三代头孢菌素，以减轻抗菌药物的选择性压力，防止产ESBLs菌株的产生和流行。
本文药敏试验敏结果显示ESBLs菌株对亚胺培南、阿米卡星的耐药率分别为0、7.69%，因此我院暂时将此两药作为临床经验用药。
ESBLs基因定位于质粒，由于质粒可以通过接合由供体菌转至受体菌，通过接合试验确证91株对利福平敏感的大肠埃希菌的ESBLs基因定位于质粒，了解产ESBLs大肠埃希菌在同种菌株之间的水平传播情况。本研究提示我院大肠埃希菌临床分离株对复方磺胺甲口恶唑、庆大霉素、头孢吡肟和头孢西丁的耐药性有一部分是通过质粒介导的，但主要是通过染色体或其他耐药机制介导的。大多数资料表明喹诺酮类药物的耐药性是仅通过染色体介导的［9］，但近年来有许多报道认为喹诺酮类药物的耐药性也可以通过质粒传播［10］，从我院大肠埃希菌临床分离株的接合试验药敏结果来看，喹诺酮类药物耐药性有一部分是通过质粒介导的，但主要是通过染色体介导。
总之，大肠埃希菌产ESBLs发生率和水平传播率很高，且大肠埃希菌在不同标本、不同科室的分离率和耐药性有较大差异，因此在临床治疗时，应根据药敏结果选用合理的抗生素，延缓耐药株的产生。
作者： 赵晓丽 胡大春 周玲 刘德华 蒋杰《中国抗生素杂志》
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