中药对产β－内酰胺酶大肠埃希菌的敏感性研究

【摘要】  目的 对产β－内酰胺酶（ESBL+）大肠埃希菌进行中药体外敏感试验，观察其结构改变对中药治疗作用的影响。方法 采用琼脂扩散法，以临床收集的ESBL（+）大肠埃希菌30株为实验组，非产酶的大肠埃希菌30株为对照组，进行体外敏感性研究，所选中药通过水提、醇提法制备药液，观察各种药物的最低抑菌浓度。结果 所试中药体外抑菌效果从强到弱依次为：半枝莲水提液、蒲公英醇提液、射干醇提液、白头翁醇提液、半枝莲醇提液、鱼腥草水提液、射干水提液、白头翁水提液、鱼腥草醇提液、蒲公英水提液。对实验组与对照组细菌的抑菌效果经统计学分析，差异无显著性（P>0.05）。结论 对ESBL(+)大肠埃希菌引起的感染，在抗生素选择压力增大的情况下，中药可以成为治疗的较好选择，无需实验室对其确认是否产酶。

【关键词】  中药；产β－内酰胺酶大肠埃希菌；非产酶大肠埃希菌；体外敏感性

    近年，产β－内酰胺酶（ESBL+）大肠埃希菌引起的各类感染越来越多，治疗此种细菌引起的感染，青霉素类、头孢菌素类及氨曲南是无效的。细菌的产酶及突变是否影响中药的治疗作用呢？这一方面未曾见有报道，为此笔者选择了具有清热解毒、清热燥湿作用的中药通过水提与醇提的方法制备药液，对ESBL（+）大肠埃希菌进行了体外敏感性的对比研究，并对有效中药进行筛选，现报告如下。

    1  实验材料

    1.1  中药选择  鱼腥草：三白草科植物蕺菜Horttuynia   cordata Thunb.的干燥地上部分，切段。射干：鸢尾科植物    射干Belamcanda chinensis(L.)DC.的干燥根茎，切片。蒲公英：菊科植物蒲公英Taraxacum mongolicum Hand.-Mazz.、碱地蒲公英T.sinicum Kitag.或同属数种植物的干燥全草，切段。半枝莲：唇形科植物半枝莲Scutellaria barbata D.Don的干燥全草，切段。白头翁：毛茛科植物白头翁Pulsatilla chinensis(Bge.) Regel的干燥根，切薄片。以上药物均购自我院中药房。

    1.2  实验菌株  来自本院门诊及病房临床标本中分离的大肠埃希菌（仪器：英国先德SENSITITRE全自动微生物鉴定仪，鉴定符合率95%以上）。选择经鉴定为ESBL（+）大肠埃希菌30株为实验组，ESBL(-)大肠埃希菌30株为对照组。

    ２  实验方法

    2.1  中药制备

    2.1.1  中药水提液  取中药鱼腥草、射干、蒲公英、半枝莲、白头翁各500g，分别置提取容器中，加水适量，浸泡20min，继续加水6～8倍（根据药物容积不同，加水量不同），加热煎煮提取2次（2h, 2h），过滤去渣，合并2次提取液，慢火浓缩至500ml左右（1g/ml），灌封，备用［1］。

    2.1.2  中药醇提液  取中药鱼腥草、射干、半枝莲、白头翁各500g，分别置提取容器中，加65%乙醇适量，浸泡20min，继续加提取溶剂6～8倍量，加热煎煮提取2次（2h, 2h），过滤去渣，合并2次滤液，回收乙醇。慢火浓缩至500ml左右（1g/ml），灌封，备用［1］。

    2.2  ESBL确认  采用NCCLS推荐的抑制剂增强的纸片法进行，若任一复合纸片抑菌圈直径与单一纸片抑菌圈直径相比≥5mm，即判为产ESBLs菌，若<5mm，则判为非产ESBLs菌。所选择的30株ESBL(+)菌中，头孢噻肟阳性14株，头孢噻肟、头孢他啶二者均为阳性者16株，无单纯头孢他啶阳性菌株。

    2.3  菌液制备  挑取培养18～24h的纯菌落，制成0.5麦氏单位，浓度相当于(1～1.5)×108cfu/ml的菌悬液，备用。

2.4  操作  先以打孔法进行预试，琼脂稀释法配制浓度。采用2倍稀释法，配制成６份不同浓度的供试药液，浓度依次为0.5、0.25、0.125、0.0625、0.0312、0.0156，根据要求加入M-H琼脂，装瓶，灭菌，倾注平板。将每个平板分成若干份，编号。取10μl菌悬液加到平板表面，放35～37℃孵箱培养，24h观察结果，并记录，以48h无菌生长之最低浓度作为最低抑菌浓度（MIC）。

    3  结果

    经48h培养观察，实验组及对照组细菌在含有不同浓度的中药平板上表现出不同的生长状况，见图1。其MIC结果见表1～3（为统计方便，对在浓度为0.5平板上仍有细菌生长之最终浓度定为1.0）。表1  不同中药对两组细菌的MIC比较 表2  中药的不同提纯方法对实验组细菌的MIC比较表3  中药的不同提纯方法对对照组细菌的MIC比较从表1中可以看出，中药鱼腥草醇提液、射干水提液、白头翁水提液、蒲公英水提液对实验组及对照组细菌的平均MIC值均在0.4以上，笔者认为其抑菌作用应视为较弱，但其复方的作用及在体内的作用如何尚有待进一步研究。鱼腥草水提液、射干醇提液、白头翁醇提液、半枝莲水提液、蒲公英醇提液对实验组及对照组细菌在抑菌效果上经统计学分析，差异无显著性（均P>0.05）。而半枝莲醇提液对两组细菌的MIC经统计学分析，差异有显著性（P<0.05），醇提液对ESBL(+)大肠的作用优于ESBL(-)。

    从表２、表３中可以看出，鱼腥草水提液、半枝莲水提液对两组细菌的抑菌效果均优于相应的醇提液，而射干醇提液、白头翁醇提液、蒲公英醇提液无论对实验组细菌还是对对照组细菌抑菌效果均明显优于相应的水提液，其MIC值经统计学分析，差异有非常显著性（均P<0.01）。

    4  讨论

近年来，由于抗生素的不合理应用，使细菌的耐药性增强，多重耐药菌株不断增加，在医院的各类感染中，革兰阴性细菌仍是主要的感染菌，而其中又以大肠埃希菌为多［2］。大肠埃希菌是产酶的主要细菌，其产β－内酰胺酶的细菌分离率逐渐增加［3］。该酶是质粒介导的耐药酶，它不仅能水解青霉素和第一、二代头孢菌素，还能水解第三代头孢菌素及氨曲南等，并且ESBL的耐药基因编码经常与其他的耐药基因相联结，从而使耐药性更加复杂，抗生素选择更加困难，出现了“抗生素耐药危机”，给临床治疗带来极大难度。目前针对非产酶大肠的中药研究报道较多，但产酶大肠的诸多改变能否对中药的抑制作用产生影响，这方面的研究鲜有报道，笔者选择了具有清热解毒、清热燥湿作用的中药12味，并对其中的鱼腥草、射干、半枝莲、蒲公英、白头翁进行醇提、水提对比，为中药在对抗特殊耐药菌方面的作用提供了科学有效的实验资料，对中药的推广应用将产生重要意义。

  作者：吴国英，栾耀芳，孙进学，王军，孔祥山 《中华医学实践杂志》

【参考文献】

  1 谢秀琼.现代中药制剂新技术.北京：化学工业出版社，2004,4.

2 古东东，段蕴铀，张红鹰，等.临床标本细菌分离及细菌耐药性监测.中药医院感染学杂志，2003,13(1):67-70.

3 周田美，董晓勤，施新颜，等.产超广谱β－内酰胺酶的检测及药敏分析.中华医院感染学杂志，2003,13(5):484-485.

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