大肠埃希菌耐药性质粒的提取及鉴定

【摘要】  目的 检测大肠埃希菌对9种抗生素的耐药性，探讨大肠埃希菌耐药的分子机制。方法采用平皿二倍稀释法测定40株临床分离的大肠埃希菌对抗生素的敏感性，同时用碱裂解法对耐药菌株进行质粒的抽提，将得到的质粒转化至受体菌JM109进行质粒耐药性的鉴定。结果 40株大肠埃希菌对头孢菌素等9种抗生素呈现出不同程度的耐药现象。对氨苄西林和青霉素的耐药性分别达到了87.5%和97.5%。从两株耐药大肠埃希菌中提取出质粒，对其中一株进行转化鉴定，确定为耐药质粒，大小约为3.0kb。结论 临床分离大肠埃希菌对多种抗生素表现出较高的耐药性，而耐药性质粒的存在是细菌产生耐药性的机制之一。

【关键词】  大肠埃希菌；耐药性；质粒

    Extraction and identification of resistance plasmids in Escherichia coli

    【Abstract】  Objective  To detect the antibiotic susceptibility of E.coli strains to 9 antibacterial agents and to explore the molecular mechanism of resistance in E.coli.Methods  Antibiotic susceptibility of 40 strains of E.coli isolates were carried out by the agar dilution method.Plasmid DNA were extracted by alkaline lysis and R plasmid was identified by transformation.Results  40 strains of E.coli isolates exhibit resistance to 9 different antibiotics in some extent.The resistant rates to ampicillin and penicillin were 87.5% and 97.5%,respectively.Two plasmids of 3.0kb were isolated from two strains of E.coli.Conclusion  40 strains of E.coli isolates exhibit resistance to 9 antibiotics and molecular mechanisms of resistance in some strains of E.coli were mediated by R plasmid in part.

    【Key words】  Escherichia coli;drug resistance;plasmid

    大肠埃希菌是引起呼吸道和泌尿生殖道感染的常见条件致病菌［1］。随着第三代头孢菌素的广泛应用，此类细菌表现出较严重的多重耐药性，并常导致严重的院内感染，使得抗菌感染治疗变得棘手。近年来大量文献证实了产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）是造成大肠埃希菌对第三代头孢菌素的耐药性重要原因［2］。质粒介导的耐药性是细菌产生耐药性的原因之一，携带多种耐药表型的R质粒常在某一地区流行并在一定条件下可在细菌中传播。因此，对耐药机制的研究是预防和控制细菌耐药的战略措施［3］。本研究对40株临床分离的大肠埃希菌进行了耐药性的测定，并对耐药菌株进行了质粒的提取及鉴定。

　　1  材料与方法

    1.1  材料

    1.1.1  菌株来源  40株大肠埃希菌由临床分离并进行鉴定。大肠杆菌JM109由本实验室保存。

    1.1.2  药品和试剂  氨苄西林，青霉素（购自华北制药股份有限公司）；头孢拉定，头孢噻肟钠，头孢哌酮钠，头孢曲松钠（购自上海先锋药业有限公司）；红霉素（购自大连美罗大药厂）；阿奇霉素（购自杭州澳亚生物技术有限公司）；盐酸环丙沙星（购自贵州科伦药业有限公司）；酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）（购自BioFlux公司）；普通营养琼脂培养基（购自杭州天和微生物试剂有限公司）。质粒提取液：溶液Ⅰ：含50mmol/L的葡萄糖，25mmol/L Tris·C1（pH8.0），10mmol/L EDTA；溶液Ⅱ：含0.2mol/L NaOH和1%SDS（现用现配）；溶液Ⅲ：5mol/L KAc 60ml，HAc 11.5ml，水28.5ml配置成100ml的溶液。

    1.2  方法

    1.2.1  药敏试验  采用常规琼脂二倍稀释法检测40株大肠埃希菌对9种抗生素的最低抑菌浓度（MIC）以及MIC50和MIC90。

    1.2.2  质粒DNA的提取  采用碱裂解法［4］。挑取单个菌落，接种于7ml LB液体培养基（含抗生素）中，37℃、震荡培养过夜（约12～14h）。取1.5ml培养物加入Eppendorf管中，4℃、12000×g离心1min，弃上清，使细菌尽可能干燥。将细菌重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中，剧烈震荡，使菌体分散。加200μl新配制的溶液Ⅱ，上下颠倒5次混匀，置冰上2min。加入150μl预冷的溶液Ⅲ，温和的混匀10s，置冰上5min。4℃、12000×g离心7min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，震荡混匀1min，4℃、12000×g离心5min，小心移出上清于另一Eppendorf管中。重复上一步骤再抽提1次。加入1/10体积的3mol/L NaAc混匀，再加入2倍体积的无水乙醇，-20℃沉淀30min。4℃、12000×g离心15min，去上清，室温干燥。70%乙醇洗涤1次，室温干燥5min。沉淀溶于20μl TE（含RNAse 20μg/ml）中，震荡混匀，-20℃保存备用。

    1.2.3  感受态细胞的制备（氯化钙法）［4］  从37℃过夜培养的大肠杆菌平板中挑取单一菌落，转至2ml LB液体培养基中，37℃、震荡培养过夜。取培养物1：40稀释到新鲜LB液体培养基中，37℃继续震荡培养至吸光度值为0.4左右（约2.5h）。菌液冰浴10min，4℃、12000×g离心1min，弃上清。加1/2初始培养物体积预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮菌体，冰浴10min，4℃、12000×g离心1min，弃上清。加1/25初始培养物体积预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮菌体，4℃保存备用。

    1.2.4  质粒的转化［4］  取200μl感受态细胞于1.5ml Eppendorf管中，加入3μl DMSO（二甲亚砜）混匀，加入10μl质粒DNA混匀，置冰上30min。42℃水浴90s，迅速转移到冰上30min。加满LB液体培养基重悬菌体。37℃震荡培养45min。将混合液涂在预热的含有抗生素（100μg/ml）的LB固体培养板上，37℃过夜培养。观察细菌生长状况，并挑取单个菌落接种培养。

    1.2.5  转化菌株耐药性的鉴定  将转化菌株接种到含抗生素的琼脂平板上，过夜培养，观察转化菌株的生长状况。并采取碱裂解法对其进行质粒DNA的提取。

    1.2.6  琼脂糖凝胶电泳  用0.8%琼脂糖（含0.5/ml溴化乙锭）100V电泳40min，紫外透射仪上观察结果。

　　2  结果

    2.1  药敏试验结果  40株临床分离大肠埃希菌对各种抗生素的耐药结果见表1。表1  40株大肠埃希菌对9种抗生素的耐药结果（略）从表1可知，40株大肠埃希菌对氨苄西林和青霉素的耐药性较高，分别为87.5%和97.5%，对头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢哌酮钠、头孢拉定的耐药率分别为17.5%、22.5%、40%、75%，红霉素和阿奇霉素为82.5%和42.5%，盐酸环丙沙星的耐药率为47.4%。

2.2  质粒DNA提取结果  用碱裂解法对两株耐药菌株进行质粒的抽提，得到分子量都近似为3.0kb的质粒。其结果见图1。

    M：maker;1、2：提取质粒

    图1  质粒电泳图谱2.3  质粒鉴定结果  将其中一株3.0kb的质粒转化至大肠杆菌JM109感受态细胞中，接种在含氨苄西林（100μg/ml）的培养基上，挑取单个菌落接种于LB中培养12～24h，碱裂解法提取质粒DNA，经琼脂糖凝胶电泳，可见从转化菌中提取的质粒与原质粒粉质量相等。结果见图2。

    M：maker;1：转化质粒；2：原质粒

    图2  质粒及其转化子

    2.4  转化菌株耐药性的鉴定结果  转化菌对氨苄西林、青霉素、红霉素、阿奇霉素、头孢哌酮钠、盐酸环丙沙星耐药，而对头孢噻肟钠、头孢曲松钠敏感。

　　3  讨论

    自20世纪90年代以来，随着三代头孢为代表的β-内酰胺类药物的广泛使用，细菌的耐药性增加并出现了产超广谱β-内酰胺酶（ESBLs）的耐药菌株的流行［5］。大肠埃希菌是产ESBLs主要代表菌之一，因此大肠埃希菌所引起的感染不应忽视其耐药机制在给临床治疗方面所带来的困扰，而产超广谱β-内酰胺酶可以由质粒编码，所以质粒在细菌耐药机制方面起非常重要的作用。质粒DNA上的ESBLs编码基因常常可以在结合性质粒的tra操纵子、非结合性质粒的启动系统（oriT及mob基因）、转座子（Tn）以及整合子（Int）的作用下通过转化、转导、结合等方式在同种属甚至不同种属细菌的质粒之间或质粒与染色体间不断转移，导致更多的细菌产生ESBLs，并通过整合和重组使细菌产生多重耐药性［6］。

    本项工作通过对40株临床分离大肠埃希菌耐药性的测定，发现其中大部分细菌呈现出多重耐药，对传统药物如：青霉素、氨苄西林表现出较明显的耐药，其耐药率分别高达97.5%和87.5%，对头孢噻肟钠、头孢曲松钠、头孢哌酮钠、头孢拉定的耐药率分别为17.5%、22.5%、40%、75%，红霉素和阿奇霉素为82.5%和42.5%，盐酸环丙沙星的耐药率为47.4%。由此可见，抗生素的不合理使用已使一些抗生素失去了其抗菌作用，应引起社会和医疗界的重视。

    本次研究从两株耐药大肠埃希菌中提取出了两种质粒，其分子量均为3.0kb左右，经转化鉴定为耐药质粒。其转化子表现出对氨苄西林、青霉素、红霉素、阿奇霉素、头孢哌酮钠、盐酸环丙沙星耐药，而对头孢噻肟钠、头孢曲松钠敏感，说明该地区大肠埃希菌对氨苄青霉素等的耐药性部分由质粒决定，而其对抗生素的耐药性则可能是由染色体介导的。由此可见，带有耐药基因的质粒，在导致耐药性的产生中扮演着重要的角色，因此研究和开发质粒消除的药物也显得十分重要。

 作者：张帆，李菁华，史红艳，孙延波    《中华医学实践杂志》

【参考文献】

  1 Levy SB.Factors impacting on the problem of antibiotic resistance.J Antimicrob Chenother,2002,49:25.

2 康梅，陈超杨，Norman Hui,等.超产广谱β-内酰胺酶大肠杆菌的脉冲场凝胶电泳分型研究.四川大学学报·医学版，2004，35（2）：214-216.

3 赵静，杨汉春.大肠杆菌耐药性R质粒研究进展.中国兽医杂志，1997，23（9）：44.

4 J·萨姆布鲁克，EF·弗里奇，T·曼尼阿萨斯.分子克隆试验指南，第2版.北京：科学出版社，1992，10.

5 Farrell DJ,Morrissey I,De Rubeis D,et al.A UK multicentre study of the antimicrobial susceptibility of bacterial pathogens causing urinary tract infection.J Infect,2003,46(2):94-100.

6 韩伟，张铁，王春光，等.大肠埃希菌多重耐药性的形成机制.动物医学进展，2006，27（1）：51-53.

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