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耐亚胺培南的铜绿假单胞菌的研究



录入时间:2011-1-13 9:30:49 来源:中国论文下载中心

铜绿假单胞菌是一种临床上常见的医院内的条件致病菌,本研究通过对耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药分析,了解耐亚胺培南铜绿假单胞菌的耐药机制,以利于临床合理用药。现报道如下。
  1  资料与方法
  1.1  资料 
  (1)菌株:收集自2005年1至12月本院VITEK-32仪检出的耐亚胺培南铜绿假单胞菌22株。铜绿假单胞菌标准菌株ATCC 27853一株;(2)药敏纸片:头孢塞肟、头孢曲松、头孢他定、亚胺培南;(3)OprD2基因扩增试剂盒:裂解液A、裂解液B、反应液、耐热酶、阳性模板;(4)其他:9.8%(EDTA·K2+NA2HPO4),无菌生理盐水,M-H平板,血平板等。
  1.2  方法 
  (1)纸片扩散法初筛:将新分离的纯菌种配成0.5McFarland密涂于M-H琼脂平板(Φ70mm)10min后于平板中央贴上EDTA纸片,纸片分2组:1组为头孢塞肟、头孢曲松,在距离EDTA纸片1cm处对称分别贴上头孢塞肟和头孢曲松。另1组为头孢他定、亚胺培南,在距离EDTA纸片1cm处分别贴上头孢他定、亚胺培南。35℃培养24h后观察结果。结果判断:①出现协同现象可能为产金属酶;②不出现协同现象可能为膜通透障碍或既产金属酶又有膜通透障碍;(2)粗提酶(冻融裂解法)将新分离的纯菌种配成0.5McFarland,取50μl于肉汤中35℃培养增菌24h后取1ml于离心管(1.5ml)中,-80℃反复冻融数次,培养无菌生长后于4℃离心机,以10000转/min离心25min,取上清液后-80℃保存待用;(3)改良三维试验[1]: 将铜绿假单胞菌标准株ATCC27853配成0.5McFarland密涂于M-H平板(Φ90mm)待干后于平板中央贴上亚胺培南纸片,距纸片2mm处分别成180°打2个宽1mm、长2cm的槽(标明①②),在①加酶粗提液20μl、②加酶粗提液+EDTA(9:1)35℃培养24h后判断结果    
  结果判断:①有扩大生长、②抑菌圈光滑完整则为产金属酶;②有扩大生长、①抑菌圈光滑完整则为产金属酶以外的碳青酶烯酶;①、②抑菌圈均光滑完整则为膜通透性障碍;(4)PCR:菌株处理:挑取少许新分离的纯菌种置入内含无菌生理盐水(100μl)的离心管(0.5ml),离心15000rmp5min,弃上清液,加裂解液A 50μl,裂解液B 2μl,混匀后置入55℃保温1h后置入95℃保温5min ,离心10000rpm30 min,上清液即为扩增的模板液。反应体系配制:将反应液管内液体全部移入耐热酶管,以15μl至20小管,实验时将5μl膜板液移入反应体系中并加盖石蜡油2滴即可。热循环参数:95℃预变性2min然后93℃30min→55℃30min→72℃60min共循环35周期,最后一个周期72℃延长至2min。结果观察:取扩增产物10μl与2μl溴酚兰指示剂混匀,点样于2%琼脂糖凝胶中,以100v电压电泳20~30min,出现与阳性膜板分子量相同的条带(193bp)即为阳性。
  2  结果
  2.1  表型初筛结果 
  22株铜绿假单胞菌中有10株产生协同现象占45.4%。  
  2.2  改良三维试验结果 
  22株铜绿假单胞菌中有5株产金属酶占22.7%。
  2.3PCR结果    
  22株铜绿假单胞菌中有4株为OprD缺失,即由膜通透障碍引起占18.8%。 
  2.4  22株铜绿假单胞菌抗菌药物敏感性统计见表1。表1  22株铜绿假单胞菌的抗菌药物敏感性统计 (略)
讨论
亚胺培南是一种新型的β-内酰胺类抗生素,属碳青酶烯类,具有较好的抗菌活性,且对β-内酰胺酶稳定[2],是治疗假单胞菌感染活性最强的药物之一,但随着临床的广泛使用,耐亚胺培南菌株开始出现并日益增多,严重限制了亚胺培南的应用。铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药常不是由单一因素造成的,目前认为造成本菌耐亚胺培南的已知主要原因有4种,即(1)产生β内酰胺酶:据Pai 等报道部分菌株可能产β-类酰胺酶[3],本实验中由于产金属酶而耐药的菌株为5株(22.7%);(2)膜通透性障碍:即其外层细胞壁的外膜蛋白D2是碳青霉烯类抗生素进入的通道,失去特异性外膜蛋白D2导致药物不能进入细菌体内,Statake等[4]认为患者接受过其他内酰胺类药物抗感染治疗后,会诱导铜绿假单胞菌失去其膜蛋白通道oprD2,从而对亚胺培南形成耐药,本实验OprD2基因扩增结果显示:22株铜绿假单胞菌中有4株菌株表现为OprD2缺失(18.8%);(3)细胞外膜主动外排系统的表达;(4)青霉素结合蛋白的改变:本实验未涉及3、4点,在此也作详叙述。以上可见碳青霉烯类抗生素耐药机制的复杂性。因此,在治疗铜绿假单胞菌引起的疾病时,建议在临床上选择抗菌药物时以细菌培养为前提,药敏实验结果为依据,合理选择敏感的药物治疗方案[5],防止耐药菌株的出现和传播。
 
作者:李苏娅 史煜波《浙江临床医学》
【参考文献】
    1 陈东科,张志敏,张秀珍.三维法检测β-内酰胺酶的影响因素探讨方法的改进.中华检验医学杂志,2003,26(10):600~604.
  2 朱琴,彭少华. 铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素的耐药机制.医学新杂志,2002,12(4):206~207.
  3 Pai H , Kim J . Carbapenem resistance mechanis in pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Antimicrob Agents Chemother ,2001,45:480~484.
  4 Statake S, Yoneyama H , Nakae T. Role of Omp D2 and chromosomal βlactamase in carbopenem resistance in clinical isolates of pseudomones aeruoginosa. J Antimicrob Chemother ,1991,28:199~207.
5 叶晓光,王若伦. 铜绿假单胞菌耐药性动态变化特征及分析. 中华医院感染学杂志,2004,14(6):607~609.

 

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