探讨酵母菌涂片半定量检测在诊断真菌感染中的价值

【摘要】  目的 探讨酵母菌涂片半定量检测在诊断真菌感染中的重要性。方法对不同稀释度的酵母菌菌液分别进行半定量涂片检测，同时应用CHR0magar念珠菌显色培养基进行半定量培养。结果当酵母菌浓度>10 cfu／ml时，半定量涂片、培养与计数成正相关。结论酵母菌检出数量与菌液浓度呈正相关，涂片半定量与培养有良好的相关性。直接涂片染色镜检对真菌感染的早期诊断能提供科学的依据。

【关键词】  真菌感染；酵母菌涂片；半定量检测

     近20年来，随着高效广谱抗生素的广泛应用，侵袭性真菌感染的发生率呈上升趋势［1］。在美国，1992～1993年与1980～1982年相比，念珠菌的发病率由2.6/106增至72.8/106。真菌感染患者的上升率占所有病原感染患者上升率的首位。在我国，近几年真菌检出率亦呈明显上升趋势。加之真菌感染的临床表现缺乏特异性，早期诊断非常困难，患者大多为免疫力低下患者，所以病情严重，发展迅速，治疗困难，病死率相当高［2］。因此，需要检验工作人员尽快、准确地检出病原为临床确诊真菌感染提供科学的依据。目前，对真菌感染性疾病进行病原学诊断的常用方法为直接涂片镜检和接种培养基分离培养。由于直接涂片染色镜检具有简便和早期快速的特点，因此已在结核分枝杆菌等抗酸性细菌感染的早期初步诊断中广泛应用［3］。本文拟采用涂片直接镜检与分离培养法对含有不同浓度真菌的标本进行检查，旨在探讨涂片半定量对真菌感染标本的诊断价值。

    1  材料与方法

    1.1  材料  菌种白色念珠菌（Candida albicans）为本室保存菌种（一株）。培养基为法国科玛嘉（CHROmagar）培养基，按说明书配置倾注平板。日本OLYMPUS光学显微镜。BASO快速革兰染液。

    1.2  方法

    1.2.1  改良牛鲍计数盘（NeubaueI·hemocytometer）计数  用无菌生理盐水将白色念珠菌配成一定浓度的菌悬液，吸取菌液充满计数盘计数区，在低倍显微镜下计数，使浓度为105／ml，再加入生理盐水稀释为104、103、102、101／ml。

    1.2.2  半定量涂片检查  于酒精灯火焰上烧灼载玻片以炭化污染菌，待冷；用接种环无菌操作，取不同稀释度菌液一环分别涂片，每个稀释度涂片5张，革兰染色后镜检。按下述标准记录半定量结果：全片未见为（-），≤2个／100视野（10×100）为极少量，3～9个／100视野为少量，1～9个／10视野为（+），1～9个／视野为（++），10～99个／视野为（+++），≥100个／视野为（++++）。

    1.2.3  分离培养  以无菌操作取不同稀释度菌液一接种环（10 μl），分别划线接种于法国科玛嘉培养基平板，每稀释度菌液接种于两个科玛嘉平板，置温箱35 ℃培养24 h后计数菌落数（CFU）。

    2  结果

    2.1  涂片半定量结果  见表1表1  不同稀释度菌液半定量涂片与培养的结果

    2.2  培养与涂片的关系  菌液浓度≥10 cfu／ml时涂片镜检能获得阳性结果，此时分离培养亦获得阳性结果。

    2.3  五张涂片结果  通过每稀释度菌液五张涂片结果发现，每次结果不完全一致。

3  讨论

    由表1可知，涂片半定量（++++）相当于菌液浓度104～105 cfu／ml，（+++）相当于菌液浓度为103～104 cfu／ml，（++）相当于菌液浓度为102～103 cfu／ml，（+）相当于菌液浓度为101～102 cfu／ml，当真菌浓度≥10 cfu／ml时，半定量涂片、培养与计数呈正相关，并有良好的相关性。

    直接涂片镜检具有快速、简便、经济、实用等特点，易于推广，且可帮助确定真菌的临床意义，指导标本的正确采集和培养方法的选择［2］。这就弥补了培养法易受污染，并且出结果时间长等不足，符合快速诊断真菌感染的要求。

    由于正常人口腔、消化道及泌尿道中存在酵母菌，如果涂片看到真菌，不一定是感染菌，应警惕定植或过路菌。涂片只能初步判断是否存在真菌，因此报告结果时应该半定量，给临床医师提供一个量的概念，以便医师通过涂片就能初步判断是感染还是定植，这样可以做到早期诊断、早期治疗。对呼吸道标本，在保证标本合格以及临床症状、体征和（或）医学影像检查不能除外呼吸道真菌感染的前提下，直接涂片镜检≥少量即可确诊［5］。所以直接涂片染色镜检时应该报告真菌的量，即做到半定量。

    为了提高直接涂片镜检的阳性率，应该正确采集标本，涂片应取标本中的异常部位，液体标本离心后取沉渣涂片［4］。镜检时应低倍镜下观察全片以免漏检。一次取材、一张涂片的检出率仅为55％，即通常所做的涂片方法有45％的漏检率，用三张涂片的检出率为75％，因此要增加取材次数，每次多张涂片镜检［4］。临床医师不应因一次涂片检测阴性而排除诊断，应该多张涂片多次送检。如果在抗酸染色等其他染色方法时观察到真菌应报告临床，提请医生注意。

综上所述，由于酵母菌半定量涂片直接、客观、快速、影响因素少等特点，可以为临床快速、早期诊断真菌感染提供科学依据。酵母菌涂片应做到半定量报告临床，以便帮助临床医生迅速判断有无真菌感染，从而采取适当的治疗方法，来挽救病人生命，减轻病人痛苦，节省经济开支。

 

作者：宋素景，时东彦 《中华现代外科学杂志》

【参考文献】

  1 刘伟，李若瑜.抗真菌药物敏感性试验在真菌感染防治中的作用.中华检验医学杂志，2005，28：349-351.

2 卢先雷.临床真菌检验方法的选择和组合.中华检验医学杂志，2004，27：201-203.

 

3 朱以勇，王和.感染性标本涂片镜检与分离培养相关性的研究.贵州医药，2002，26：409-410.

4 程守科.直接涂片镜检诊断深部真菌病.内科急危重症杂志，2001，7：99-100.

5 杨擎立，胡馥生.呼吸道真菌感染病原学诊断标准的探讨.中华检验医学杂志，2003，26：615.