注射用盐酸索他洛尔无菌检查的方法验证

【摘要】  目的：建立注射用盐酸索他洛尔的最佳无菌检查方法，保证检验结果的准确和可靠性。方法：按中国药典2005年版二部（附录Ⅺ H）无菌检查法中的薄膜过滤法进行。结果：样品管无菌生长，六株阳性对照菌生长良好。结论：方法学验证采用薄膜过滤法进行的无菌检查，可行。

【关键词】  注射用盐酸索他洛尔无菌检查法（薄膜过滤法） 方法学验证

　　无菌检查时必须选择适宜的方法消除其抗菌作用，才能保证检验结果的准确和可靠性。为此我们按照《中国药典》2005年版二部（附录Ⅺ H）无菌检查法项下薄膜过滤法的要求对注射用盐酸索他洛尔进行了实验，对其无菌检查方法进行了验证。

　　1  仪器与材料

　　1.1  仪器  HTY-2000A型智能集菌仪及全封闭式无菌过滤培养器（杭州高得医疗器械有限公司）。

　　1.2  供试品  注射用盐酸索他洛尔（吉林市卓怡康纳制药有限公司，规格40mg/支，批号为060201）。

　　1.3  培养基及冲洗液  硫乙醇酸盐流体培养基（批号：050907）、改良马丁培养基（批号：060419）、营养肉汤培养基（批号：050919）、营养琼脂培养基（批号：060330）、PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液（批号：0604242），均由北京三药科技开发公司提供。

　　1.4  验证试验用菌种  ①金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；②铜绿假单胞菌[CMCC（B）10 104]；③枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]；④生孢梭菌[CMCC（B）64 941]；⑤白色念珠菌[CMCC（F）98 001]；⑥黑曲霉[CMCC（F）98 003]；以上菌种均由中国药品生物制品检定所提供。

　　2  方法与结果

　　按中国药典2005年版二部无菌检查法（附录Ⅺ H）方法验证进行试验。

　　2.1  菌液制备

　　2.1.1  取经36℃培养20h的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的肉汤新鲜培养物1ml加入0.9%的无菌氯化钠溶液9ml，10倍稀释至10－6约为50～100cfu/ml，备用。

　　2.1.2  取经36℃培养20h的生孢梭菌硫乙醇酸盐流体培养物1ml，加入0.9%的无菌氯化钠溶液9ml，10倍稀释至10－6约为50～100cfu/ml，备用。

　　2.1.3  取经26℃培养48h的白色念珠菌改良马丁液体培养物1ml，加入0.9%的无菌氯化钠溶液9ml，10倍稀释至10－6约为50～100cfu/ml，备用。

　　2.1.4  取经26℃培养1周的黑曲霉斜面培养物，加0.9%的无菌氯化钠溶液10ml，将孢子洗脱后，吸出孢子悬液，用垫有脱脂棉的漏斗（湿热灭菌）过滤，除去菌丝，收集菌液至另一无菌试管内作为原液。取此原液0.1ml，加0.9%无菌氯化钠溶液9.9ml，稀释至10－5约为50～100cfu/ml，备用。

2.2  菌液计数

　　每种菌液接种2个平皿，取其平均值。取金黄色葡萄球菌液、铜绿假单胞菌液、枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液各1ml注入约15ml营养琼脂平皿，36℃培养，白色念珠菌、黑曲霉菌菌液各1ml注入约15ml改良马丁培养基26℃培养，计数，结果见表1。

　　表1  验证用菌液的稀释度及接种量（略）

　　3  验证方法的选择

　　3.1  方法验证试验1

　　取一次性全封闭式无菌过滤培养器（两联）一套，在一管中先泵入培养基并夹紧管口，再将10瓶供试品按薄膜过滤法滤至另一管并泵入相同培养基，于两管中分别接入小于100cfu的试验菌。前者作为阳性对照管，阴性对照管即分别将硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基泵入另两管培养器中培养，按规定温度将上述培养器培养3～5天，各试验菌同法操作，见表2。

　　表2  方法验证试验1：试验组与阳性对照组检验结果（略）

　　注：对照组：菌液＋培养基；试验组：供试品＋菌液＋培养基；阴性对照组：硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基。

　　3.2  方法验证试验2

　　取一次性全封闭式无菌过滤培养器（两联）一套，在一管中先泵入培养基并夹紧管口，将10瓶供试品按薄膜过滤法滤至另一管，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分3次冲洗，每次200ml，泵入相同培养基，于两管中分别接入小于100cfu的试验菌。前者作为阳性对照管，阴性对照管即分别将硫乙醇酸盐流体培养基及改良马丁培养基泵入另两管培养器中培养，按规定温度将上述培养器培养3～5天，各试验菌同法操作。结果六株阳性对照菌正常生长，见表3。

　　表3  方法验证试验2：试验组与阳性对照组检验结果（略）

　　4  样品的无菌检查

　　取本品30瓶按薄膜过滤法滤至一次性全封闭式无菌过滤培养器（三联）中，用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液分3次冲洗，每次200ml，2管加入硫乙醇酸盐流体培养基（其中1管接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌作为阳性对照管），第3管加入改良马丁培养基，按规定温度培养14天，逐日观察，供试品管均澄清，阳性对照管生长良好，供试品符合规定。

　　5  讨论

无菌检查的目的既要保证标准规定的所有阳性对照菌正常生长，又要准确无误的检查样品染菌情况，所以对其进行验证是十分必要的。在药品的无菌检查中，需要用冲洗液进行冲洗的品种不能简单的按药品的用途来分类，还包括精神类药品及抗病毒类药品等。注射用盐酸索他洛尔是化学类药品，方法验证试验1没有进行冲洗的薄膜过滤法，结果在该条件下对生孢梭菌有抑菌作用。方法验证试验2用PH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗后才消除其抑菌成分，故可作为注射用盐酸索他洛尔的无菌检查法。

 

作者：李立冬 费丽娜《中国医学杂志》