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比浊法快速测定硫酸多黏菌素E效价


录入时间:2011-1-19 8:56:01 来源:中国论文下载中心

【摘要】  研究比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律,建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速测定方法,检测时间由杯碟法的20h缩短到4h。当硫酸多黏菌素E的效价为30~100u/ml时,检测菌液接种浓度为5%,培养时间为4h,吸光度对数值与抗生素效价具有良好的线性关系。本法重现性好,相对误差小于5%。
【关键词】  硫酸多黏菌素E 比浊法 效价
    Fast determination of the potency of polymyxin E by turbidimetry assay
    ABSTRACT  A turbidimetry assay for fast determination of polymyxin E potency was developed by studying on the influencing factors. Compared with Oxford assay, turbidimetry assay decreased the determination time from 20 hours to 4 hours. There was a linear relationship between the potency of polymyxin E and the logarithm of absorbency in the range of 30~100u/ml and inoculating concentration was 5%, with 4hour culture time. The turbidimetry assay had a good reproducibility, and the relative error was less than 5%.
    KEY WORDS  Polymyxin E;  Turbidimetry assay;  Potency
     多黏菌素E(polymyxin E或colistin)是由多黏芽孢杆菌抗敌素变株(Bacillus polymyxin var.colistinus)经发酵培养生产的一种环状多肽类抗生素,它对革兰阴性杆菌有强烈的抑菌作用[1]。由于多黏菌素E具有高效、低毒、残留少的特性,将其硫酸盐制成兽药用于防治由大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌等革兰阴性菌[2]引起的肉鸡、猪、牛等畜禽的肠道疾病。目前采用杯碟法[3,4]测定其生物效价。杯碟法操作步骤复杂,耗时长,测定时间需要大约20h,不能快速反馈工业生产中各个阶段产品生物活性,必须开发一种快速测定硫酸多黏菌素E效价的方法。比浊法是抗生素效价微生物检定的方法之一[5~8],其原理是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内,混匀后,经短期培养,测量培养物的吸光度,在一定线性范围内细菌培养物吸光度的对数值logA与抗生素的浓度成正比,比浊法具有检测快速的特点。本文深入研究了比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律,建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速检测方法。
    1  材料与方法
    1.1  材料
    (1)检定菌  大肠埃希菌(CMCC(B)44102)购自微生物菌种保藏中心。
    (2)硫酸黏杆菌E素(硫酸多黏菌素E)标准品  中国兽医药品监查所提供,批号K02700902,效价19536u/mg。
    (3)主要仪器  752紫外分光光度计;恒温水浴振荡器;牛津杯(不锈钢,高100mm,外径8.0mm,内径6.0mm);PHS3C精密pH计。
    1.2  方法
    (1)检定培养基的制备  称取蛋白胨8g,牛肉膏4g,酵母粉5g,磷酸氢二钾3.3g,磷酸二氢钾1g,氯化钠4.5g,葡萄糖2.5g,加蒸馏水至1000ml加热混匀,调节pH值为7.2,过滤,115℃灭菌30min。
    (2)检测菌液的制备  取大肠埃希菌的琼脂斜面培养物一支,加0.9%灭菌生理盐水1ml洗下菌苔转入茄瓶,37℃培养18~22h,用0.9%灭菌生理盐水15ml洗下菌苔,制成菌液,在分光光度计上波长为600nm处用0.9%灭菌生理盐水调节菌液吸光度值(A=2左右),用此菌液分以2.5%、5%和10%的接种量接种至检定培养基作为检测菌液。
    (3)硫酸多黏菌素E标准溶液的配制  精确称取硫酸多黏菌素E标准品,用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释到600u/ml,再用水稀释成浓度分别为30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种浓度的标准溶液。
    (4)比浊法吸光度测定  精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液,加9ml检测菌液,放入恒温水浴摇床以200r/min转速37℃振荡培养一定时间,取出,立即用冷水冷却,摇匀,以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比,用分光光度计在600nm波长处[9]分别测定吸光度。
    (5)比浊法样品检测  将样品稀释到适当浓度后,按实验1.2.(4)中有关步骤操作测定吸光度,在吸光度对数效价标准曲线上查对应的效价,乘以稀释倍数,即得到样品的效价。
    2  结果与讨论
    2.1  检测条件的选择
    (1)大肠埃希菌生长曲线的测定  将大肠埃希菌菌液分别以2.5%、5.0%和10%的接种量接入检定培养基,37℃条件下以200r/min振荡培养,在600nm处每小时检测一次培养物的吸光度,结果如Fig.1所示。大肠埃希菌在自然状态下生长时延迟期一般为1h左右,这一时期菌体生长缓慢,菌量基本上维持在最低水平;然后进入指数期,这一时期大约持续7~8h,这一时期菌体生长速率常数最大,生长最迅速;9h以后进入稳定期,菌体总量保持不变。当菌体生长时间在2~4h,吸光度值达到0.4~1.0,处于最佳检测时期。
    Innoculating concentration: 1: 2.5%;  2: 5%;  3: 10%
    Fig.1    Cell growth curve of E.coli    (2)检测菌液接种浓度的选择  将接种浓度分别为2.5%、5.0%和10%的检测菌液按实验1.2.(4)培养2h,绘制吸光度效价曲线(Fig.2)。 由Fig.2可见,不同接种浓度的检测菌液对培养物的吸光度影响较大。当检测菌液接种浓度为2.5%时,由于初始接种量少,少量抗生素的存在能够完全抑制菌体的生长,菌体几乎不能生长;当检测菌液接种浓度为10%时,菌体生长很快,抗生素难以抑制菌体生长,不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度不明显;当检测菌液接种浓度为5%时,不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度区别明显,灵敏度高,因此5%接种浓度的检测菌液适合本法测定硫酸多黏菌素E效价。
    Innoculating concentration: 1: 2.5%;  2: 5%;  3: 10%
    Fig.2    Effect of different innoculating concentration
    on absorbency
    (3)培养时间的选择  接种浓度5.0%的检测菌液,按实验1.2.(4)分别培养2、3和4h,绘制吸光度效价曲线(Fig.3)。由Fig.3可见,在实验菌接种量固定在5%的条件下,增加培养时间,灵敏度提高显著。培养时间为2h,吸光度效价曲线比较平坦,灵敏度低,当培养时间增加为4h,不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度区别明显,灵敏度高,因此选择4h作为培养时间用于检测。
2.2  标准曲线的确立
    精密吸取30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种硫酸多黏菌素E标准溶液各1ml,加9ml接种浓度为5%的检测菌液,放入恒温水浴摇床以转速200r/min 37℃培养4h,取出,立即用冷水冷却,摇匀,以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比,用分光光度计在600nm波长处分别测定吸光度,以硫酸多黏菌素E浓度为横坐标,吸光度对数值为纵坐标,绘制标准曲线(Fig.4)。
    将吸光度对数值对相应浓度进行线性回归,得到回归方程:
    lgA=-0.01039C+0.1837  r=0.9953
    可见硫酸多黏菌素E的浓度在30~100u/ml的范围内与吸光度对数值呈良好的线性关系。
    2.3  重现性测定
    用比浊法对3个不同规格的硫酸多黏菌素E样品进行重现性试验,检测4次结果见Tab.1,相对标准偏差在3%以内,重现性较好。
    2.4  正确性测定
    以杯碟法[10]测定效价数据为标准,得出本方法的准确度(Tab.2);比浊法测定的相对误差在5%以内,符合药典规定要求,提示比浊法能够准确测定硫酸多黏菌素E效价。
    3  结论
    (1)比浊法能够快速、准确地测定硫酸多黏菌素E效价,检测时间由杯碟法的20h缩短到4h,方法重现性好,相对误差小于5%。
    (2)比浊法进行硫酸多黏菌素E效价测定时应注意培养基的质量以及检测仪器等。培养基配置后应过滤后再灭菌,以免培养基中形成沉淀影响测量。试管应选同一批、同一型号,管壁均匀一致,试管洁净无污染,以免影响测量结果。培养结束后立即冷却,测定前应摇匀。
 
 作者:佟斌 吴兆亮 殷昊 赵艳丽 《中国抗生素杂志》
【参考文献】
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[7] 张治锬. 抗生素药品检验[M]. 北京:人民卫生出版社,1987:80
[8] 朱会琴,逢涣欢,胡昌勤,等. 浊度法测定两性霉素B及其脂质体的效价[J]. 中国抗生素杂志,2005,30(12):752
[9] 沈萍,范秀容,李广武. 微生物学实验(第三版)[M]. 北京:高等教育出版社,1999:97
[10] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2005年版(二部)[S]. 北京:化学工业出版社,2005:附录XIA

 

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