【摘要】 研究比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速测定方法，检测时间由杯碟法的20h缩短到4h。当硫酸多黏菌素E的效价为30～100u/ml时，检测菌液接种浓度为5%，培养时间为4h，吸光度对数值与抗生素效价具有良好的线性关系。本法重现性好，相对误差小于5%。
【关键词】 硫酸多黏菌素E 比浊法 效价
Fast determination of the potency of polymyxin E by turbidimetry assay
ABSTRACT A turbidimetry assay for fast determination of polymyxin E potency was developed by studying on the influencing factors. Compared with Oxford assay, turbidimetry assay decreased the determination time from 20 hours to 4 hours. There was a linear relationship between the potency of polymyxin E and the logarithm of absorbency in the range of 30～100u/ml and inoculating concentration was 5%, with 4hour culture time. The turbidimetry assay had a good reproducibility, and the relative error was less than 5%.
KEY WORDS Polymyxin E; Turbidimetry assay; Potency
多黏菌素E(polymyxin E或colistin)是由多黏芽孢杆菌抗敌素变株(Bacillus polymyxin var.colistinus)经发酵培养生产的一种环状多肽类抗生素，它对革兰阴性杆菌有强烈的抑菌作用［1］。由于多黏菌素E具有高效、低毒、残留少的特性，将其硫酸盐制成兽药用于防治由大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、沙门菌等革兰阴性菌［2］引起的肉鸡、猪、牛等畜禽的肠道疾病。目前采用杯碟法［3，4］测定其生物效价。杯碟法操作步骤复杂，耗时长，测定时间需要大约20h，不能快速反馈工业生产中各个阶段产品生物活性，必须开发一种快速测定硫酸多黏菌素E效价的方法。比浊法是抗生素效价微生物检定的方法之一［5～8］，其原理是将一定量的抗生素加至接种有试验微生物的液体培养基内，混匀后，经短期培养，测量培养物的吸光度，在一定线性范围内细菌培养物吸光度的对数值logA与抗生素的浓度成正比，比浊法具有检测快速的特点。本文深入研究了比浊法测定硫酸多黏菌素E效价的影响因素和规律，建立了硫酸多黏菌素E的比浊法快速检测方法。
1 材料与方法
1.1 材料
(1)检定菌 大肠埃希菌(CMCC(B)44102)购自微生物菌种保藏中心。
(2)硫酸黏杆菌E素(硫酸多黏菌素E)标准品 中国兽医药品监查所提供，批号K02700902，效价19536u/mg。
(3)主要仪器 752紫外分光光度计；恒温水浴振荡器；牛津杯(不锈钢，高100mm，外径8.0mm，内径6.0mm)；PHS3C精密pH计。
1.2 方法
(1)检定培养基的制备 称取蛋白胨8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氢二钾3.3g，磷酸二氢钾1g，氯化钠4.5g，葡萄糖2.5g，加蒸馏水至1000ml加热混匀，调节pH值为7.2，过滤，115℃灭菌30min。
(2)检测菌液的制备 取大肠埃希菌的琼脂斜面培养物一支，加0.9%灭菌生理盐水1ml洗下菌苔转入茄瓶，37℃培养18～22h，用0.9%灭菌生理盐水15ml洗下菌苔，制成菌液，在分光光度计上波长为600nm处用0.9%灭菌生理盐水调节菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以2.5%、5%和10%的接种量接种至检定培养基作为检测菌液。
(3)硫酸多黏菌素E标准溶液的配制 精确称取硫酸多黏菌素E标准品，用pH6.0的磷酸盐缓冲液稀释到600u/ml，再用水稀释成浓度分别为30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种浓度的标准溶液。
(4)比浊法吸光度测定 精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml检测菌液，放入恒温水浴摇床以200r/min转速37℃振荡培养一定时间，取出，立即用冷水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度计在600nm波长处［9］分别测定吸光度。
(5)比浊法样品检测 将样品稀释到适当浓度后，按实验1.2.(4)中有关步骤操作测定吸光度，在吸光度对数效价标准曲线上查对应的效价，乘以稀释倍数，即得到样品的效价。
2 结果与讨论
2.1 检测条件的选择
(1)大肠埃希菌生长曲线的测定 将大肠埃希菌菌液分别以2.5%、5.0%和10%的接种量接入检定培养基，37℃条件下以200r/min振荡培养，在600nm处每小时检测一次培养物的吸光度，结果如Fig.1所示。大肠埃希菌在自然状态下生长时延迟期一般为1h左右，这一时期菌体生长缓慢，菌量基本上维持在最低水平；然后进入指数期，这一时期大约持续7～8h，这一时期菌体生长速率常数最大，生长最迅速；9h以后进入稳定期，菌体总量保持不变。当菌体生长时间在2～4h，吸光度值达到0.4～1.0，处于最佳检测时期。
Innoculating concentration: 1: 2.5%; 2: 5%; 3: 10%
Fig.1 Cell growth curve of E.coli (2)检测菌液接种浓度的选择 将接种浓度分别为2.5%、5.0%和10%的检测菌液按实验1.2.(4)培养2h，绘制吸光度效价曲线(Fig.2)。 由Fig.2可见，不同接种浓度的检测菌液对培养物的吸光度影响较大。当检测菌液接种浓度为2.5%时，由于初始接种量少，少量抗生素的存在能够完全抑制菌体的生长，菌体几乎不能生长；当检测菌液接种浓度为10%时，菌体生长很快，抗生素难以抑制菌体生长，不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度不明显；当检测菌液接种浓度为5%时，不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度区别明显，灵敏度高，因此5%接种浓度的检测菌液适合本法测定硫酸多黏菌素E效价。
Innoculating concentration: 1: 2.5%; 2: 5%; 3: 10%
Fig.2 Effect of different innoculating concentration
on absorbency
(3)培养时间的选择 接种浓度5.0%的检测菌液，按实验1.2.(4)分别培养2、3和4h，绘制吸光度效价曲线(Fig.3)。由Fig.3可见，在实验菌接种量固定在5%的条件下，增加培养时间，灵敏度提高显著。培养时间为2h，吸光度效价曲线比较平坦，灵敏度低，当培养时间增加为4h，不同浓度抗生素对菌体生长的抑制程度区别明显，灵敏度高，因此选择4h作为培养时间用于检测。
2.2 标准曲线的确立
精密吸取30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8种硫酸多黏菌素E标准溶液各1ml，加9ml接种浓度为5%的检测菌液，放入恒温水浴摇床以转速200r/min 37℃培养4h，取出，立即用冷水冷却，摇匀，以9ml未接种检定培养基和1ml水混合液作参比，用分光光度计在600nm波长处分别测定吸光度，以硫酸多黏菌素E浓度为横坐标，吸光度对数值为纵坐标，绘制标准曲线(Fig.4)。
将吸光度对数值对相应浓度进行线性回归，得到回归方程：
lgA=-0.01039C+0.1837 r=0.9953
可见硫酸多黏菌素E的浓度在30～100u/ml的范围内与吸光度对数值呈良好的线性关系。
2.3 重现性测定
用比浊法对3个不同规格的硫酸多黏菌素E样品进行重现性试验，检测4次结果见Tab.1，相对标准偏差在3%以内，重现性较好。
2.4 正确性测定
以杯碟法［10］测定效价数据为标准，得出本方法的准确度(Tab.2)；比浊法测定的相对误差在5%以内，符合药典规定要求，提示比浊法能够准确测定硫酸多黏菌素E效价。
3 结论
(1)比浊法能够快速、准确地测定硫酸多黏菌素E效价，检测时间由杯碟法的20h缩短到4h，方法重现性好，相对误差小于5%。
(2)比浊法进行硫酸多黏菌素E效价测定时应注意培养基的质量以及检测仪器等。培养基配置后应过滤后再灭菌，以免培养基中形成沉淀影响测量。试管应选同一批、同一型号，管壁均匀一致，试管洁净无污染，以免影响测量结果。培养结束后立即冷却，测定前应摇匀。
作者：佟斌 吴兆亮 殷昊 赵艳丽 《中国抗生素杂志》
【参考文献】
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［9］ 沈萍，范秀容，李广武. 微生物学实验(第三版)［M］. 北京：高等教育出版社，1999：97
［10］ 国家药典委员会. 中华人民共和国药典2005年版(二部)［S］. 北京：化学工业出版社，2005：附录XIA
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