黄藤素片微生物检验方法验证中加菌方法的比较研究

　［摘要］ 目的：比较黄藤素片微生物方法验证中的加菌方法不同，所出现的回收率差异。方法：采用离心法薄膜过滤法弃除黄藤素片中的抑菌成分。结果：离心前加入阳性对照菌所得回收率非常低，采用薄膜过滤法的阳性对照菌所得回收率可达70%以上，两者有显著性差异。结论：薄膜过滤法最后一次冲洗加入阳性对照菌仅能说明黄藤素片的抑菌作用可采用离心薄膜过滤法弃除，而不能反映该药品在生产、运输、贮藏过程所污染的微生物。

　　［关键词］ 微生物方法验证；抑菌作用；离心法薄膜过滤法

　　A study on the microbiology verifying test of Huangtengsu tablet with bacterial put in

　　［Abstract］ Objective:To compare the different recovery rates resulted from different methods in putting bacterial in microbiology verifying test of Huangtengsu tablet. Methods: The centrifugalization and membrane filtration were used to get rid of the components restraining bacterial from Huangtengsu tablet. Results: The recovery rate of the bacterial put into drug before centrifugalization was evidently different from that after the last washing of membance filtration. Conclusions: The result of putting bacterial into drug after membrane filtration may not illustrate some bacterial contaminated in production, transportation and garner.

　　［Key words］ Microbiology verifying test; Bacteriostasis function; The centrifugalization and membrane filtration

   

　　2005版《中国药典》在药品微生物限度检验方法项下增加了方法学验证的内容，特别对有抑菌作用的药品指出可采用离心沉淀集菌法、薄膜过滤法或联合使用这些方法消除抑菌作用，并要求阳性菌的加入方法是最后一次滤膜冲洗时。针对黄藤素片的抑菌情况，笔者采用离心薄膜过滤法消除其抑菌，并就其加入阳性对照菌的方法进行了比较，发现加入阳性对照菌的方法不同，所得到的回收率差异是非常显著的。

　　1  材料和方法

　　1.1  试验材料

　　1.1.1  样品  黄藤素片分别由玉溪维和制药有限公司（批号20040113，样品1）、昆明制药有限公司（批号20040452，样品2）、云南滇池制药有限公司（批号20040701，样品3）提供。

　　1.1.2  稀释剂及培养基  无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）按药典配制，TTC营养琼脂培养基、营养肉汤培养基［1］均来源于北京三药科技开发公司。

　　1.1.3  阳性对照菌  大肠杆菌［CMCC（B）44102］、金黄色葡萄球菌［CMCC（B）26003］、枯草芽孢杆菌［CMCC(B)63501］、白色念珠菌［CMCC（F）98001］［1，2］，由中国药品生物制品检定所提供。

　　1.2  方法

　　1.2.1  供试品的制备  分别取样10 g，匀浆后加入无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）至100 mL，制成1∶10供试液备用［1］。

　　1.2.2  阳性菌液制备  取相应菌株的营养琼脂培养基斜面新鲜培养物1白金耳，接种至营养肉汤培养基内，培养18～20 h后用无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）稀释至相应的浓度［1］，备用。

　　1.2.3  试验Ⅰ组  分别吸取1∶10约含50～100个/mL阳性菌的供试液10 mL，置无菌离心管中，经500 r/min离心5 min后，以无菌操作取上清液1 mL置无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）100 mL中，加入装有直径为50 mm、孔径为（0.45±0.02）μm的微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）冲洗滤膜3次，每次50～100 mL，取出滤膜，按上述操作分别进行5次，各置5皿，再注入约45 ℃的TTC营养琼脂培养基约15 mL，混匀，37 ℃培养48 h后计数。

　　1.2.4  试验Ⅱ组  分别吸取1∶10供试液10 mL置无菌离心管中，经500 r/min离心5 min后，以无菌操作取上清液1 mL置无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）100 mL中，加入装有直径为50 mm孔径为 (0.45±0.02)μm的微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）冲洗滤膜3次，每次50～100 mL，最后一次冲洗时同时加入1 mL约含50～100个/mL阳性菌菌液，取出滤膜，按上述操作分别进行5次，各置5皿，再注入约45 ℃的TTC营养琼脂培养基约15 mL，混匀，37 ℃培养48 h后计数。

　1.2.5  供试品对照组  分别吸取1∶10的供试液10 mL，经500 r/min离心5 min后，以无菌操作取上清液1 mL置无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）100 mL中，摇匀，以无菌操作加入装有直径为50 mm孔径为（0.45±0.02）μm的微孔滤膜的过滤器内，减压抽干后，用无菌磷酸盐缓冲液（pH 7.2）冲洗滤膜3次，每次50～100 mL，取出滤膜，按上述操作分别进行5次，各置5皿，再注入约45 ℃的TTC营养琼脂培养基约15 mL，混匀，37 ℃培养48 h后计数。

　　1.2.6  阳性对照组  取制备好的约含50～100个/mL的阳性菌菌液1 mL，置于平皿中，分别置5皿，再注入约45 ℃的TTC营养琼脂培养基约15 mL，混匀，37 ℃培养48 h后计数。

　　1.2.7  阴性对照组  取试验用的稀释液10 mL，照上述离心薄膜过滤法操作，作为阴性对照。

　　2  结果

　　2.1  药典常规方法结果采用2005年版《中国药典》［1］常规方法检测三个批号黄藤素片阳性菌回收率，在1∶10的稀释级仅只有大肠杆菌加菌的回收率能达到70%以上，而在1∶10、1∶100的稀释级加入其他三种标准菌，其回收率均远远低于70%。说明样品有很强的抑菌作用，因此黄藤素片的微生物限度检测不能采用常规方法检测。

　　2.2  不同加菌方法阳性对照菌回收率由于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌在1∶10、1∶100的回收率无法达到药典要求，且黄藤素片中含有一定的辅料，故改用离心薄膜过滤法测定。不同加菌方法阳性对照菌回收率结果见表1、表2。

　　表1  试验Ⅰ组阳性对照菌回收率　略

　　表2  试验Ⅱ组阳性对照菌回收率组别　略

　　3  讨论

采用离心薄膜过滤法消除黄藤素片的抑菌作用，若在离心前加入阳性对照菌，4种阳性标准菌的回收率非常低，这可能与离心沉降以及操作转移过程中阳性菌的损失和黄藤素片供试液对阳性菌液存活率的影响有关。在薄膜过滤的最后一次冲洗时加入阳性菌，上述4种阳性菌的回收率均达到70%以上。两种方法回收率的差距甚远。在薄膜过滤法最后一次冲洗时加入阳性对照菌，尽管回收率已达到了中国药典2005版微生物限度检验验证方法的要求，但这仅只能说明该药品的抑菌作用可采用离心薄膜过滤法去除，而不能反映该药品在生产、运输、贮藏过程中污染的微生物，因为所污染的微生物可能在弃除抑菌的处理过程中有损失。尽管采用离心薄膜过滤法弃除药品中的抑菌作用是非常有效的处理办法，但笔者认为本法仅考虑到消除药品的抑菌作用而忽略了采用该法可能导致药品在生产、运输、贮藏过程污染的微生物在处理过程中损失的情况。鉴于微生物的特殊性，目前微生物检验方法非常局限，如何能既消除药品的抑菌作用同时又能保证在生产、运输、贮藏过程污染的微生物不损失，还有待进一步研究。

 

作者：范兵，杜娟，陈林芳《儿科药学杂志》

　　参考文献：

　　［1］ 药典委员会. 中华人民共和国药典(一部)［S］. 2005年版. 北京: 化学工业出版社, 2005: 附录7173.

     ［2］ 马绪荣, 苏德模. 药品微生物学检验手册［M］. 北京: 科学出版社, 2000: 62, 6869, 82.