中药对广州地区流感嗜血杆菌抑菌作用研究

［摘要］ 目的：探讨中草药对广州地区流感嗜血杆菌的体外抑菌作用。方法：采用琼脂稀释法检测流感嗜血杆菌对中药的最低抑菌浓度。结果：6种中草药水煎剂均有不同程度的抑菌作用，其中黄连抑菌效果最好，黄连水煎剂对流感嗜血杆菌MIC50为1 g/L，MIC90为2 g/L。结论:中药对流感嗜血杆菌有不同程度抑菌作用。

　　［关键词］ 中草药；抑菌作用；流感嗜血杆菌

　　Experimental Research on Antibacterial Effect of Chinese Herbal Medicines on Haemophilus Influenzae in Guangzhou

　　Abstract:Objective To explore the antibacterial effect of Chinese herbal medicines on Haemophflus influenzae in Guangzhou．Methods Minimal inhibitory concentratiOn(MIC) of the extracts affecting on bacteria was assayed by agar dilution．Results Six kinds of herbs decoction had different antibacterial effects on Haemophilus influenzae，among which Coptis washighly active against Haemophilus influenzae.Its MIC50 was 1 g/L.Conlusion Some chinses herbs had bacterionstatic effect against Haemophilus.

　　Key words:Chinses herbs;Bacteriostasis;Haemophilus influenzae

    流感嗜血杆菌是引起社区获得性肺炎最常见致病菌之一，近年来在临床检出率不断增多；流感嗜血杆菌在发展中国家小儿急性下呼吸道感染中分离率高达45％。世界各国发现流感嗜血杆菌耐药菌株特别是β内酰胺酶阳性的耐氨苄西林菌株的报道日益增多［1，2］，给临床治疗带来极大的困难。由于耐药菌株的大量出现可导致临床治疗失败，感染复发，住院时间延长，增加患者的经济负担和生理压力。中药具有清热解毒、滋补、抗菌等作用，且具有副作用小、抗耐药性好等特点，开始得到人们的广泛关注。为此，本课题进行了中药对本地区临床分离的流感嗜血杆菌体外抑菌效果的研究，为临床预防感染、临床治疗用药提供依据。

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株来源  2004年7月至2004年12月广州地区5家医院(广州市第一人民医院、广州市儿童医院、中山大学附属第二医院、广州医学院附属第一、第二医院)从临床分离的156株流感嗜血杆菌，按常规鉴定方法［3］：将痰及咽拭子标本按常规方法接种在血琼脂和巧克力平板上，35 ℃ 5％CO2环境下培养过夜，挑选2个~4个可疑菌落至血平板及胰大豆平板上作卫星试验。并在另一胰大豆平板上贴X+V因子、X因子、V因子纸片，各纸片相距5 cm。只在血平皿上卫星试验阳性、在胰大豆平板上卫星试验阴性，以及只在X+V因子纸片周围生长、X因子、V因子纸片周围不生长的菌落可判定为流感嗜血杆菌。

　　1.2  中草药  黄连、黄柏、黄芩、连翘、千里光和金银花共6种中药，均由我院购自广州市药材公司。

　　1.3  抗生素纸片  氨苄西林、红霉素、复方甲基异  唑、氯霉素、环丙沙星、阿莫西林／克拉维酸、头孢呋新和头孢噻肟均为英国OXOID公司产品。

　　1.4  培养基  HTM药敏培养基和添加剂为英国OXOID公司产品。

　　1.5  中药煎制  参照陈奇的方法［4］进行，将100 g中药于砂锅，加200 ml蒸馏水浸泡30 min后用慢火煎至水量浓缩为100 ml过滤，药渣再加水200 ml煎煮、过滤，将2次滤液共200 ml煎煮浓缩成100 ml，使中药浓度为1 g／ml。经高压蒸汽灭菌后备用。中药的最低抑菌浓度(MIC)的测定：按NCCLS推荐的琼脂稀释法测定实验菌株的MIC值，用流感嗜血杆菌ATCC49619作参考质控菌株。

　　制备中药琼脂平板，中药和HTM药敏培养基琼脂按比例混合，最终含药浓度为250．0 g／L、125．0 g／L、62．5 g／L、31．25 g／L、15．62 g／L、7．81 g／L、3．90 g／L、1．95 g／L、0．98 g／L。

　　制备菌液，菌液调整为0．5麦氏单位后再作1∶10稀释，用1 μl定量接种环点种于琼脂表面，最终琼脂上所含接种菌量为104 cfu／ml。

　　采用多点接种法，首先点种生长对照平板(不含中药)，随后从最低浓度开始，依次点种不同浓度的中药平板，放35 ℃孵育24 h，记录无菌生长的最低中药浓度。

　　1.6  抗生素敏感试验  采用KB法进行，操作和结果判断严格按照NCCLS制定的最新规则及标准进行;用标准菌株ATCC49247作为质量控制。

　　1.7  数据统计分析  用WHO提供的WHONET5．3软件统计，分析MIC50及MIC90的中药浓度和抗生素的敏感试验。

　　2  结果

　　2.1  抗生素的敏感试验  156株流感嗜血杆菌中β内酰胺酶阳性的占25％，除头孢噻肟外，对抗生素均出现不同程度的耐药，其中对复方甲基异  唑耐药率最高，达53．4％，其次为环丙沙星、氨苄西林、氯霉素，详见表1。

　　2.2  抑菌作用  6种中药对156株小儿流感嗜血杆菌均有不同程度的抑菌作用，其中黄连抑菌效果最好，黄连水煎剂对流感嗜血杆菌MIC50为1 g/L，MIC90为2 g/L;黄芩、黄柏、金银花和千里光水煎剂对流感嗜血杆菌MIC50分别为2 g/L、4 g/L、4 g/L、2 g/L、2 g/L，MIG90分别为4 g/L、16 g/L、16 g/L、8 g/L、8 g/L。

表1  常用抗生素对流感嗜血杆菌的药敏结果(略)

　　3  讨论

　　流感嗜血杆菌是引起肺炎、中耳炎、败血症和脑膜炎的常见病原菌，在儿科病例中尤为常见，是儿童呼吸系统感染主要病原菌之一，被认为是学龄前儿童中继肺炎链球菌后造成急性中耳炎的第二种病原菌。氨苄西林于20世纪70年代初期取代氯霉素和四环素成为治疗流感嗜血杆菌感染的首选药物，1974年首次分离出产TEM1型β内酰胺酶的氨苄西林耐药菌株。目前氨苄西林耐药菌株遍及全球。美国及欧洲国家，自20世纪70年代中期至80年代中期流感嗜血杆菌耐药呈上升趋势，20世纪80年代后期和20世纪90年代初则上升减慢。亚洲国家和地区同样存在流感嗜血杆菌的流行，菲律宾氨苄西林耐药率为6．3％，韩国为9％，泰国为14．6％，香港20％，而台湾高达35．7％。本组氨苄西林耐药率为20．5％，较欧美国家的耐药率高，却比台湾要低，这可能与广州地区对氨苄西林的口服制剂应用频度较高有关。随着抗生素广泛使用，细菌耐药性已成为全球所关注的焦点，尤其是近几年来一些条件致病菌如流感嗜血杆菌能引起原发性化脓感染及严重继发感染。自1974年在欧洲报道首例耐氨苄西林的流感嗜血杆菌菌株以来，越来越多的耐药菌株在世界上报道，由于耐药菌株的大量出现可导致临床治疗失败患者感染复发，住院时间延长，大大增加了患者及社会的负担。由于中药的抑菌作用不同于抗生素，因此日益受到临床重视，本实验从药效学角度比较了黄连、黄芩等6种不同清热解毒中药水煎液对流感嗜血杆菌抑菌作用，结果各种中药均有不同程度的抑菌作用，抑菌效果最好是黄连，其次是黄芩、金银花和千里光；连翘抑菌效果相对较弱，黄连水煎剂的MIC50只有1 g/L。

　　中药的抑菌机制尚不清楚，有报道通过对中药与抗生素作用后菌落直径大小的比较，提示了中药成分可能具有与一般抗生素不同的抑菌机制［5］，流感嗜血杆菌对β内酰胺类抗生素耐药是由于细菌产生青霉素酶，对四环素的耐药机制主要为获得外源性DNA编码产生四环素泵出系统，或产生具有核蛋白体保护作用的蛋白质，也可以因为染色体突变导致外膜渗透性降低。对四环素的耐药性通常系质粒介导，含tetB基因的流感嗜血杆菌含能量依赖泵出系统，可在四环素到达靶位核糖体前将其泵出［6］。而中药抑菌成分较多，可作用于细菌的不同部位和繁殖的不同阶段，并对细菌的多个代谢环节作用，故不易产生耐药性。

　　清热解毒药物不仅具有抑菌作用，并且能通过调节机体的整体免疫反应和改变机体的局部微环境条件，从而达到清除病原菌，提高临床疗效的目的。本次研究采用的是体外抑菌实验，在体内能否达到抑菌浓度，控制感染，有待继续探讨。本试验用于中药的最低抑菌浓度(MIC)测定采用NCCLS推荐的琼脂稀释法，该法是测定抗生素敏感性的一门成熟的技术，但是中药浓度不好控制，浓度增大时琼脂难以凝固，药物浓度太低，又达不到中药的抑菌浓度，也有待继续探讨完善检测方法。

中药药源广泛、价格低廉，具有广阔开发潜力。因此积极探讨中药的抑菌作用，以指导临床合理使用中药协同抗生素治疗细菌感染，对减少细菌耐药性的产生有着积极的意义。

 

作者：叶惠芬，刘平，陈惠玲，李尚文《实用医技杂志》

　　参考文献：

　　［1］  盛朝凯，刘岚，朱军，等．儿童呼吸道感染苛氧菌耐药性分析［J］．中华现代儿科学杂志,2004,1(2)：106108.

　　［2］  王琴，孟曙芳，孔艺．134株嗜血杆菌体外抗生素敏感性分析［J］.检验医学,2004,19(4)：304306.

　　［3］  叶应妩，王毓三．全国临床检验操作规程［M］.第2版.南京：东南大学出版社，1997：479486.

　　［4］  陈奇．中药药理研究方法学［M］.北京：人民卫生出版社，1993：261.

　　［5］  张玉妥，张艳芳，季建军，等.中药对耐甲氧西林葡萄球菌体外抑菌作用的研究［J］．江苏中医,2001,22(3)：43．

［6］  姜敏，杨永弘．流感嗜血杆菌对常用抗生素的耐药性及耐药机制［J］.国外医学儿科学分册,2004,31(5)：228230.