金银花二氧化碳超临界萃取物的体外抑菌作用研究

【摘要】  目的研究金银花CO2超临界萃取(SFE)物的体外抑菌作用。方法采用琼脂扩散法和试管稀释法研究金银花的5种提取工艺，即SFE萃取、SFE-C萃取(C表示带夹带剂)、乙醇提取、超声波提取、共水蒸馏（SD）法提取，所得提取原液药物对6种细菌，即金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的抑菌作用。结果5种提取原液药物对6种细菌均有一定抑制作用，而且SFE萃取物对绿脓杆菌的MIC 为1∶16；SFE-C萃取物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的 MIC 均为1∶16。结论与传统的提取方法相比，采用SFE-C和SFE工艺得到的萃取物含非绿原酸类热敏抗菌物质，提高了金银花的抗菌效果。

【关键词】  金银花 二氧化碳超临界萃取 夹带剂 体外抑菌

    Abstract：ObjectiveTo research the growth inhibition of CO2-SFE extracts from Lonicerae on bacteria in vitro. MethodsThe agar diffusion and tube dilution methods were used to study the growth on bacteria inhibition of the Lonicerae extracts with five different kinds of extraction approaches, which were SFE extraction, SFE-C extraction, alcohol extraction, ultrasonic extraction and SD extraction, by applying them to the following bacteria: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus albus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium. ResultsAll Lonicerae extracts with five kinds of extractions were effective to the bacteria;the MIC against Pseudomonas aeruginosa of SFE extracts was 1∶16；The MIC against Staphylococcus aurous and Pseudomonas aeruginosa of SFE-C extracts was 1∶16. ConclusionCompared with the conventional extractions methods, the extracts with SFE-C extraction and SFE extraction include the heat-sensitive substances which would enhance the inhibiting bacteria ability.

    Key words：Lonicerae;   CO2 Supercritical extraction;   Cosolvent;   In vitro inhibition

    金银花为忍冬科Caprifoliaceae忍冬属Lonicera植物的干燥花蕾或带初开的花，为中医常用药，具有清热解毒、凉风散热之功效［1］。现代药理研究表明金银花具有较为广泛的药理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎解热、保肝、抗生育、抗氧化、止血等，这些研究为金银花的临床用药提供了科学依据，但所确定的有效部位均是水提取物或醇提取物［2，3］，有效成分不够明确和具体，因此难以建立有效的质量控制方法。

    针对以上不足，我们采用不同的提取工艺，对金银花加入夹带剂CO2超临界（SFE-C）萃取［4］、未加夹带剂CO2超临界(SFE)萃取［5］、乙醇醇提取［6］、超声波提取、共水蒸馏法（SD）提取［7］5种提取原液药物中的挥发油类、黄酮类及绿原酸类成分分别进行了富集处理，采用琼脂扩散法和试管稀释法对各个提取物进行了体外抑菌实验研究。

    1  仪器与材料

    1.1  药品JYH-1(采用SFE-C工艺提取物，其中JYH-X表示第x种金银花提取物，后面括号给出提取工艺说明)：山东产金银花药材，烘干，研碎，再放入萃取釜，加入夹带剂，在35 ℃下，萃取 2 h，将萃取物中溶剂夹带剂旋转蒸发除掉得到萃取物（萃取率为18.61 ％，绿原酸得率为 69.52 ％）。

    1.1.1  JYH-2(SFE萃取物)山东产金银花药材，烘干，研碎，再放入萃取釜中，在萃取温度为 35 ℃下，萃取时间 2 h，得萃取物挥发油（萃取率为1.08 ％）。

    1.1.2  JYH-3(醇提绿原酸)山东产金银花药材，烘干，研碎，10倍量的75 ％ 乙醇回流2次，60℃，0.5 h/次，再回收乙醇，水浴浓缩，蒸馏水洗入100 ml容量瓶，定容得到绿原酸提取物（得率为79.43 ％）。

    1.1.3  JYH-4(超声波提取黄酮)山东产金银花药材，烘干，研碎，放入锥形瓶中，加入95 % 乙醇50 ml，在冰水浴中用超声波振荡器振荡20 min，将提取液过滤至100 ml容量瓶中，残渣再重复振荡提取2次，将3次的滤液合并，在水浴上减压蒸馏得到黄酮提取物（黄酮的含量为0.002 9%）。

    1.1.4  JYH-5(SD法提取挥发油)取金银花适量，参照2005年版《中国药典》Ⅰ部的方法用水蒸气蒸馏法提取金银花挥发油，提取时间6 h，得到金银花挥发油（得率为 0.025%）。

    1.2  培养基

    1.2.1  固体培养基 牛肉膏蛋白胨细菌培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉提取物3.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0。

    1.2.2  肉汤培养基蛋白胨10.0 g，牛肉提取物3.0 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0。

    1.3  菌株所用菌株包括由浙江工业大学生物制药研究所提供的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌以及由中国科学院微生物研究所购得的绿脓杆菌、白色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌共6种。

2  方法

    2.1  测药物的抑菌圈直径定性分析药物的抗菌作用采用琼脂扩散法［8］。每平皿加0.1 ml 菌液（菌液浓度为 1.0×105 cfu/ml），涂布整个培养基表面，37 ℃，吸附 30 min。然后上面均匀放置 4 个直径约为 6 mm 的无菌不锈钢牛津杯。然后用移液器在孔中加药液 200 μl；37 ℃恒温培养箱内培养 24 h 后，观察并记录抑菌圈的有无及其直径大小（重复 2 次，每次做 4 孔，求直径的平均值）。

    2.2  定量测量药物对细菌的最低抑菌浓度 (MIC) 及最小杀菌浓度 (MBC)采用试管稀释法，（每种药物每种菌）用无菌小试管11只排于试管架，第1只不加肉汤培养基，第2～11管各加1 ml；于第1只试管中加入配置好的药液2 ml，然后取 1 ml 加入第2管，混匀后取1 ml 加入第3管，依次倍比稀释，自第10管吸出1 ml 弃去，第11管系对照管。将各管中加入已校正浓度的菌液（1.0×105 cfu/ml）0.1ml，混匀后放置37 ℃培养24 h ，观察结果，找出阻止细菌生长的最低药物浓度，3次实验结果的平均值即为金银花的最小抑菌浓度（MIC）。将MIC以上浓度的培养基各浓度取 0.1 ml倾注琼脂培养基（每浓度做3皿），37 ℃，24 h后，观察细菌生长情况，以每药物最低无菌生长浓度（3皿都无菌生长）来判断各药物的最低杀菌浓度（MBC）。

    3  结果

    3.1  药物的抗菌作用JYH-1，JYH-2，JYH-3，JYH-4和JYH-5这5 种提取原液药物的生药含量分别为5.4，92.6，1，2.6，4.0 kg /ml。按照实验方法“2.1”，对6种细菌做抗菌实验。实验结果见表1。由表1可见，5种提取原液药物对6 种细菌均有一定抑制作用。表1  各种金银花提取物抑菌圈直径的比较“-”表示无抑菌圈；n＝8

    3.2  药物对细菌的最低抑菌浓度 (MIC) 及最小杀菌浓度 (MBC)按照“2.2”项下方法进行实验。结果见表2～3。表2显示，醇提绿原酸抑菌效果最显著，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌的MIC均为1∶16；SFE-C 萃取物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌抑菌作用较强，其MIC均为1∶16；SFE萃取物对绿脓杆菌作用较强，其MIC为1∶16；SD挥发油抑菌作用最差，说明SFE萃取物挥发油强于SD挥发油抑菌效果，SFE萃取物挥发油也有一定的抑菌效果。表2  各种金银花提取物最小抑菌浓度表3  各种药物最小杀菌浓度 “-”表示无最小杀菌浓度

    表3显示，醇提物（绿原酸含量79.4％）杀菌效果最显著，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌的MBC 均为1∶8，SFE-C 萃取物对绿脓杆菌抑菌作用较强，其MBC 为1∶8；而超声提取黄酮和SD 挥发油杀菌作用弱，说明SFE-C 萃取物（其中绿原酸占26 ％，是醇提物的1/3）杀菌效果强于超声提取黄酮和SD 挥发油，接近于醇提绿原酸杀菌效果，综合考虑绿原酸含量，MBC，MIC，表明SFE-C 萃取物中含有醇提物中所没有的非绿原酸类抑菌物质；文献报道［9］金银花中有热敏性抑菌成分。SFE-CO2可较好地避免热敏成分破坏 (本文采用35℃)。本部分结果提示，金银花中含非绿原酸类热敏抑菌物质，使金银花的抑菌效果提高。

    4  结论

5种提取原液药物对6 种细菌均有一定抑制作用， SFE-C萃取物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的 MIC 均为1∶16；SFE萃取物对绿脓杆菌的MIC 为1∶16。综合考虑绿原酸含量，MBC，MIC，可知SFE萃取物和SFE-C 萃取物中含有醇提物中所没有的非绿原酸类抑菌物质。金银花中含非绿原酸类热敏抑菌物质，使金银花的抗菌效果提高。这方面工作值得进一步研究。

作者：苏香萍 龚大春 张亚雄 龚美珍《时珍国医国药》

【参考文献】

  ［1］ 国家药典委员会. 中国药典，Ⅱ部［S］. 北京：化学工业出版社，2000：177.

［2］ 赵良忠，蒋贤育，段林东，等. 金银花水溶性抗菌物质的提取及其抑菌效果研究［J］. 中国生物制品学杂志，2006，19(2)：201.

［3］ 罗 娟，李友凤，胡晓莲，等. 绿原酸的提取及稀土配合物抗菌活性测定［J］. 林产化学与工业，2007，27(2)：85.

［4］ 丁利君，吴振辉. 金银花中黄酮类物质最佳提取工艺的研究［J］. 食品科学，2002，23(2)：62.

［5］ Benvenuti F, Gironi F, Lamberti L. Supercritical deterpenation of lemon essential oil, experimental data and simulation of the semicontinuous extraction process［J］. J Supercritical Fluids, 2001, 20(1)：29.

［6］ 张雁冰，寇 娴，王桂红. 密县金银花及琪茎叶中绿原酸含量的测定［J］. 河南医科大学学报,1999,34(2)：36.

［7］ 童巧珍，周日宝. 金银花挥发油提取工艺探讨［J］. 湖南中医学院学报，2002，22(4)：24.

［8］ 潘清平，雷志君，周日宝，等. 灰毡毛忍冬与正品金银花抑菌作用的比较研究［J］. 中医药学刊,2004,22(2)：243.

［9］ 沈映君. 中药药理学［M］. 北京：人民卫生出版社,2000：230.

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