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【摘要】 目的 了解目前动物和人肠道共生的大肠埃希菌耐药性，分析其产生的原因。方法 从甘肃、湖北、北京、山东、四川等地相对封闭的养殖场及养殖场附近的健康人群采集鸡、猪、鱼、人粪便样本，分离大肠埃希菌。用API20E鉴定条鉴定怀疑为大肠埃希菌的菌种，采用KB纸片法检测生化鉴定为大肠埃希菌的菌株的耐药性，利用WHONET5.3软件进行药敏试验数据分析。用脉冲场凝胶电泳技术检测具有相似耐药谱型的大肠埃希菌菌株间的同源性。结果 ①共收集571株大肠埃希菌，其中从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类分离31株，另从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类分离嗜水气单胞菌株57株；②来源鸡的大肠埃希菌对所有检测的抗菌药物的耐药率最高；③除β内酰胺类抗生素和阿米卡星外，鸡、猪和人来源菌株的耐药率表现为高、中、低现象，对老的一些抗菌药物和喹诺酮类抗菌药物尤其明显；不同地区分离株的耐药性也有较大的差异；④本次调查首次在国内养鸡场发现产ESBL大肠埃希菌，并且非常多见；⑤嗜水气单胞菌和大肠埃希菌的耐药性有较大的差异，47株耐药谱型相近的菌株中发现了三组基因水平同源性菌株(相似度大于95%)。结论 ①从不同地区、不同种类动物分离菌株的耐药性不同，与抗生素的使用情况相关。目前我国家禽养殖业滥用喹诺酮类和β内酰胺类尤其是三代头孢菌素类抗生素的现象较为普遍，应该加以严格控制；②不同菌种的生物学特性不同，导致耐药性不同；③同源性分析发现耐药菌株可在同一种类动物间传播，不同类动物的大肠埃希菌之间可能存在耐药基因的水平传播；④应当加强养殖动物分离的大肠埃希菌耐药性监测。
【关键词】 大肠埃希菌； 养殖场； 抗生素； 耐药性
ABSTRACT Objectives To investigate the resistant profiles of Escherichia coli, the commensal intestinal isolates from pig, chicken, fish and healthy human beings. Methods E.coli isolates were recovered from fecal specimens of chicken, pig, fish and healthy human beings collected from farms of Gansu, Hubei, Shandong, Sichuan and Beijing areas. The isolates were identified by API20E system. The antimicrobial susceptibility of these isolates were tested by KB disk diffusion method, and the data were analyzed by WHONET5.3 software. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) were applied to identify the homogeneity of 47 E.coli isolates which showed similar antimicrobial resistance profiles. Results Totally 571 E.coli isolates were recovered, include 31 seawater and freshwater cultivating fish isolates. Otherwise 57 Aeromonas hydrophila isolated from seawater and freshwater cultivating fish. The chicken isolates showed the highest resistant level compared to isolates from other sources. The antimicrobials susceptibility of the isolates from chicken, pig and human were low,middling and high respectively (except betalactams and amikacin). At the same time, the antimicrobials susceptibility of the isolates from five areas were different significantly. The extendedspectrum betalactamases (ESBLs) producing E.coli isolates were recovered from poultry farm. The resistant profiles oE.coli and Aeromonas hydrophila isolates collected from fish fecal specimens were different. With PFGE analysis, three group isolates were highly homogeneous. Conclusion Antimicrobial resistance of the isolates were widely distributed in
KEY WORDS Escherichia coli; Livestock farm; Antimicrobial; Resistance
细菌耐药性是全球关注的热门话题，近年我国对引起人类疾病临床分离株的研究文献较多，抗菌药物在人类医学领域以外使用造成耐药性灾害的报道不多。畜牧业抗生素的使用导致耐药株的出现，并通过食物链传播给人，对人类健康带来严重威胁［1］。为此，国家科技部提供专项基金，由国家食品药品监督管理局细菌耐药性监测中心在我国湖北、山东、甘肃、四川和北京四省一市开展调研，现将对共生于动物及健康人肠道的大肠埃希菌的耐药性及产生的原因报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本采集和菌种分离鉴定
(1)样本的采集 2006～2007年在湖北恩施、山东半岛、北京门头沟、甘肃酒泉和四川新都地区各选择2个以上的比较封闭的养鸡场、养猪场和养鱼场，用英国Oxoid公司生产的采样拭子采集鸡、猪、鱼、正常人粪便样本。
(2)细菌的分离鉴定 先采用丹麦血清所生产的肠道菌分离鉴定用琼脂平板进行大肠埃希菌的分离，用北京三药药品生物制品开发公司生产的伊红美兰琼脂平板传纯菌株。纯菌株的鉴定采用法国BioMerieux公司的API20E肠杆菌科细菌鉴定条。
1.2 药敏试验
采用KB纸片法，质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922和ATCC35218由美国疾病控制中心提供。大肠埃希菌和嗜水气单胞菌药敏试验方法与判定标准分别参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)M100S17［2］和M45A［3］。MH琼脂平板购自天津金章科技开发公司。药敏纸片为英国Oxoid产品和北京天坛药物生物技术开发公司的产品，纸片的药物含量参照CLSI标准。产超广谱β内酰胺酶(ESBLs)菌株的确证采用双纸片法。
1.3 数据分析
药敏试验数据分析采用世界卫生组织细菌耐药性监测中心推荐的WHONET5.3软件进行。
1.4 菌株间同源性分析
(1)主要试剂 限制性内切酶XbaI购自大连宝生物公司；SeaKem Gold琼脂糖购自美国Cambrex公司；蛋白酶K为德国Merck公司产品；十二烷基肌氨酸钠、Tris base、EDTA、苯甲基磺酰氟(PMSF)、硼酸等均为美国Sigma公司产品。
(2)主要仪器 脉冲场凝胶电泳仪CHEF Mapper电泳仪和凝胶成像系统Gel/ChemiDoc系统均为BIORID公司产品。
(3)PFGE 操作方法参照美国CDC建立的PulseNet提供的方法。
(4)数据分析 将PFGE得到的电泳图谱采用BioNumerics软件(ver4.0)进行分析，以不加权成对算术平均法(unweighted pairgroup method with arithmetic average，UPGMA)为手段进行聚类分析。
2 结果
2.1 分离菌株的耐药性
从甘肃、湖北、北京、山东、四川四省一市采集鸡、猪、鱼、人粪便样本共分离大肠埃希菌571株，其中从鸡、猪和人粪便样本分离大肠埃希菌共540株，它们对常规监测用抗生素的耐药性和主要耐药谱型分别见表1和表2。从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类共分离嗜水气单胞菌57株和大肠埃希菌31株，其耐药性见表3。
2.2 不同地区动物、人源性大肠埃希菌产超广谱β内酰胺酶(ESBL)菌株分离情况
经CLSI推荐的确证试验证明本次调查共有65株大肠埃希菌为产ESBL菌株，其中以鸡来源菌株的分离率最高，其次为人源菌株，猪分离菌株未发现产ESBL菌株。不同地区动物、人源性大肠埃希菌产ESBL菌株分离情况见表4。
2.3 耐药性相似的大肠埃希菌菌株同源性分析
采用XbaI作为内切酶，对来自湖北恩施地区和甘肃酒泉地区耐药表型相似的47株大肠埃希菌菌株进行PFGE同源性分析。以95%的相似度为界限，来自同一养鸡场的大肠埃希菌xiao39、xiao27、xiao35，同一养猪场的大肠埃希菌p44和p60和养鸡场周围人群分离的hj18和hj21b分别为同源菌株；47株菌可以分成40个PFGE型别， 在不同动物种群、不同地区间未 表1 五地区鸡、猪和人来源大肠埃希菌对常规监测抗菌药物的耐药性表2 五地区鸡、猪和人来源大肠埃希菌主要耐药谱型比较表3从鱼分离到嗜水气单胞菌和大肠埃希菌表4 不同地区动物/人源性大肠埃希菌产发现同
3 讨论
大肠埃希菌是动物肠道正常菌群的一部分，在食品生产、加工和销售过程中该菌常被作为粪便污染的指示菌。在畜牧养殖业过程中，无论抗菌药物是作为治疗用还是作为促生长剂用，在抗菌药物的选择性压力下，肠道细菌很易产生耐药性变化［4，5］。因此，在本次养殖业中抗菌药物使用与细菌耐药性的危险评估的调查中，将大肠埃希菌作为代表菌用以研究和评估畜牧业使用抗菌药物对正常菌群耐药性的影响。
(1)本次调查收集了甘肃、湖北、北京、山东、四川等地鸡、猪、鱼、人粪便样本大肠埃希菌571株，其中鸡、猪和人粪便样本大肠埃希菌540株。耐药检测可见鸡来源的大肠埃希菌对所有检测的抗菌药物的耐药率最高。除β内酰胺类抗生素和阿米卡星外，鸡、猪和人来源菌株的耐药率表现为高、中、低现象，对一些老抗菌药物和喹诺酮类抗菌药物尤其明显。耐药表型分析也证明，鸡来源的大肠埃希菌多重耐药株更多，且更复杂。据不完全统计，国内数百吨的喹诺酮类抗生素被用于畜牧业，其中绝大部分是作为食用动物促生长剂来喂养家禽、猪、羊、牛甚至鱼。本文调查的现场询问表明，诺氟沙星常加在动物饮用水中，以0.01%～0.04%浓度给养殖家禽饮用。调查发现，鸡分离的大肠埃希菌对萘啶酸、环丙沙星和加替沙星的耐药率分别为88.6%、54.3%和43.5%，猪分离株分别为49.7%、19.9%和19.9%，健康人分离株分别为36.6%、14.4%和13.8%，可见喹诺酮类药物的耐药率非常高。喹诺酮类药物是治疗人类感染的重要抗菌药物之一，沙门菌和空肠弯曲菌喹诺酮耐药菌株可通过食物链传播给人类［6～8］，这是对人类感染治疗的严峻挑战，因此畜牧业滥用喹诺酮应该加予严格控制。
(2)近年来，临床大肠埃希菌产ESBLs菌株逐年增加，已引起各国临床微生物研究人员和医生的高度关注［9～13］。有关产ESBLs菌株的研究报道绝大多数是住院患者，但在患病动物分离产ESBLs菌株的报道并不多见［14～16］，从健康动物分离产ESBLs株的报道更少［17，18］。本次调查首次在国内养鸡场发现产ESBL大肠埃希菌，并且非常多见，其中四川新都鸡来源产ESBLs菌株最为多见，分离率高达50%；其次为北京门头沟地区鸡来源菌株。β内酰胺酶产生的机制主要为诱导产生，因此国内养鸡场产ESBLs大肠埃希菌的出现间接说明我国养殖业，特别是家禽养殖业滥用抗生素的现象比较普遍。据我们所知，在家禽养殖业中一日龄雏鸡多注射头孢噻呋(ceftiofur是一种第三代头孢菌素，兽用制剂为钠盐)用于预防感染，我们认为这是鸡分离株产ESBL株分离率高的原因。
(3)从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类共分离嗜水气单胞菌57株和大肠埃希菌31株，检测表明鱼分离的嗜水气单胞菌对四环素的耐药率为8.8%，对阿莫西林/克拉维酸的耐药率达到93.0%，对其它抗菌药物都几乎敏感，明显低于分离于鱼的大肠埃希菌，说明菌种耐药性的产生与菌种本身的生物学特性也有关联，大肠埃希菌更容易产生耐药性。
(4)用脉冲场电泳方法对47株耐药性相似的菌株进行同源性分析，发现来自同一养鸡场的大肠埃希菌xiao39、xiao27和xiao35，同一养猪场的大肠埃希菌p44和p60和养鸡场周围人群分离的hj18和hj21b分别为同源菌株，说明耐药菌株可在同一种群内传播和蔓延；本研究未发现在不同种群间同
(5)本次调研也存在一定的局限性：①在数以千计家禽的养殖场内，我们采集的标本所占比例相对低，样本的代表性相对较差。此外，鸡分离菌株数远多于人分离菌株，从现有菌株中发现动物直接传播到人的证据几率可能较低；②由于大肠埃希菌有上百种以上的血清型、生化型，仅从耐药谱型相似就进行同源性分析，其可行性存在一定的问题；③到目前为止，在养殖场健康动物中耐药菌株传播的资料缺少。虽然我们在交通相对闭塞的养殖场中采集了养殖场动物和养殖场附近居民的菌株，发现种内(相同动物或人)耐药菌株传播蔓延的直接证据，但种间(动物与人之间)耐药菌株的传播有待继续深入研究。虽然有很多资料阐述畜牧业使用抗菌药物对人类健康存在潜在威胁，而这一潜在威胁主要表现在食物链上，但多数资料主要表现在个例报道［19］以及食源性病原菌食物中毒暴发中［20～21］。同源性分析结果同时说明动物中分离的耐药菌株不是人身上的耐药菌株传播过去的，抗生素的选择性压力导致了耐药菌株播散以及耐药基因的水平传播。
(6)细菌耐药性产生和流行的主要原因是抗生素选择性压力和耐药基因的水平传播，同时经济发展导致的人口流动，人们的生活习惯(如养殖场工作人员、医护人员等是否经常洗手)，耐药基因的储存宿主菌在环境中的分布及自身特性等等都会影响到耐药菌株的传播和流行。我国各地区动物源性菌株的耐药性存在较大差异，间接反映了不同地区使用抗菌药物的种类和量的不同，养殖业滥用抗菌药物的现象非常普遍，后果也很严重。2002年WHO出版了抗生素使用监测报告和中止抗生素作为促进生长剂使用报告书。丹麦饲用抗生素监测结果已经证明，控制和禁止把抗生素作为饲料添加剂对于遏制细菌耐药性在动物中的出现和传播具有重要意义，我国农业部、卫生部和国家食品药品监督管理局2002年公布《禁止在饲料和动物饮水中使用药物品种目录》，为保护抗生素资源，确保对人类健康极为重要的抗生素品种［1］，特别是人类一线用药(如第三代头孢菌素、喹诺酮类抗生素)，加强监管，控制或禁止养殖业使用，以减少兽用药对临床治疗带来的危害，十分重要。同时，为遏制细菌耐药性的产生和传播，环境分离株耐药性监测需要引起相关部门的高度注意，并且要长期坚持下去，结合临床分离株耐药性的监测为制定合理的抗生素应用政策提供参考依据。
作者：李景云 崔生辉 马越 胡昌勤《中国抗生素杂志》
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