【摘要】 目的 探讨铜绿假单胞菌细菌生物膜(biofilm，BF)形成发展过程中空间立体结构变化，以及BF形成过程中与其生物学行为之间的相互联系。方法体外建立6h和1、3及6d等4个时间组铜绿假单胞菌PAO1菌株BF模型，通过绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)标记，结合激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)摄取BF形成发展各阶段不同层面的图片堆，经图像结构分析软件(image structure analyer，ISA)分析获得PAO1菌株BF相关空间结构参数定量化数据。结果 ①CLSM结合GFP标记，实现了对PAO1菌株BF动态形成过程的观察；②ISA软件定量化分析显示，随着BF发展，厚度不断增加，前3d增加程度(19.6μm)明显大于后3d(6.1μm)，区域孔率(areal porosity，AP)、平均扩散距离(average diffusion distance，ADD)和结构熵(textural entropy，TE)在BF形成的6h和6d分别为：0.98±0.01和0.92±0.02，呈现下降趋势；1.00±0.009和1.06±0.027，虽变化幅度不大，但亦呈现逐渐增加趋势；0.7±0.08和4.3±0.09，呈明显上升趋势。结论 ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空间结构特征，对细菌BF结构的定量化分析也有助于探索BF形成过程与其生物学行为之间的相互联系。
【关键词】 生物膜； 铜绿假单胞菌； 定量分析； 结构
ABSTRACT Objective To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structure Analyer (ISA) software, which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm. Methods P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours, 1 day, 3 days and 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM), based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acquired after the image information was calculated by ISA software. Results ①The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. ②The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the rate was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6μm vs. 6.1μm); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textural entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance.
KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitative analysis; Structure
长久以来，人们对细菌的认识停留在浮游态水平上，但自然界中99%的细菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。细菌BF是细菌为适应生存环境黏附惰性或活性材料表面形成的一种与浮游细胞相对应的生长方式，具有环境适应能力更强，抵抗吞噬细胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐药性极强等生物学特性，而BF的许多特性均与其特殊形态结构有关。铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我国医院和社区获得性感染及重症监护病房感染的重要条件致病菌，近年来研究证明，该菌极易形成BF［1］，临床上，有BF表型的Pa往往引起难以治愈的严重感染。以往研究多采用光镜、扫描或透射电镜等观察细菌BF结构，但样本在脱水、固定、染色等处理过程中易发生结构扭曲及关系改变。本实验通过建立体外PaO1菌株BF模型，结合绿色荧光蛋白(GFP)标记技术，运用激光共聚焦显微镜(confocal laser scanning microscopy，CLSM)摄取BF发展成熟各阶段不同层面的图像，所获图片堆经图象结构分析(image structure analyer，ISA)软件分析，获得PAO1菌株BF发展过程相关空间结构变化的数据，以期实现对细菌BF的无损伤观察，并对BF空间结构的定量化分析进行了初步探索。
1 材料和方法
1.1 试剂和菌株
铜绿假单胞菌PAO1菌株(本实验室保存)，pGFPuv质粒(Clontech公司)，质粒DNA小量提取试剂盒(日本BioFlux公司)，限制型内切酶EcoRI和HindIII(宝生物公司)，ISA软件(美国Montana州立大学Haluk Beyenal教授提供)。
(1)PAO1菌株电感受态制备 参考单志英等［2］实验方法，将过夜增菌的PAO1菌株转接于50ml SOB培养基中，
(2)pGFPuv质粒转化和转化菌株筛选 感受态细胞100μl，质粒约50ng，加入预冷的
(3)转化菌株中质粒提取和酶切电泳鉴定 挑取表达强绿色荧光的转化菌株单菌落，接种LBroth培养液，
(4)pGFPuv转化菌株建立BF模型 挑取GFP转化PAO1菌株单菌落接种LBroth培养液，
1.2 激光共聚焦显微镜观察
氩激光(488nm)激发，物镜×20，每个模型由外(BF游离的一面)向内(BF和玻片相贴的一面)逐层扫描(沿Z轴扫描)，每个标本扫描8～16张。
1.3 运用ISA软件对PAO1菌株BF结构定量化分析
将上述获得的各时间组模型图片堆调入ISA3D软件，确认图片的完整性及顺序后运行ISA及ISA3D命令，运行结果包括：①结构参数：如结构熵(textural entropy，TE)、结构能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；②平面参数：区域孔率(areal porosity，AP)、平均扩散距离(average diffusion distance，ADD)、最大扩散距离(maximum diffusion distance，MDD)等指标；③其它参数：如生物量(biovolume，BV)、比表面积(surface area between biomass and void，SA)、单位面积生物膜体积(biomass volume to surface area ratio，V2SA)等［3］。输出数据以EXCEL格式保存。
2 结果
2.1 GFP标记的PAO1菌株构建与发光表型观察
通过电转化方法对PAO1菌株进行了pGFPuv标记。转化菌株自然光下即可见绿色荧光，在紫外灯下发出强绿色荧光；荧光显微镜下，转化菌株菌体发出明亮的绿色荧光，细菌形态呈短棒状，提示pGFPuv已经成功转入了PAO1菌株中，该转化菌株可以作为BF空间结构定量化分析研究的模式菌。
2.2 转化菌株质粒提取鉴定及双酶切鉴定
转化菌株抽提质粒后，电泳结果显示在2000和3500bp之间有一条约3300bp带，条带与质粒大小吻合。提取的质粒进行EcoRI和HindIII双酶切，电泳显示在2000和3500bp之间有一条约2500bp带，在500和1000bp之间有一条约800bp带，与预期结果吻合，提示pGFPuv已成功转入PAO1菌株，并以游离质粒形式表达。
2.3 CLSM观察GFP标记BF模型
6h左右，PAO1已经在玻片上黏附聚集，发出绿色荧光；1d组模型多为绿色荧光，细菌呈微菌落聚集，已具有一定厚度；随着时间延长，BF变厚，3d组及6d组模型肉眼可见一层灰白色膜状物平铺于玻片上，镜下可见大片状BF，细菌密集，层叠如积云状，棉絮样，具备复杂空间结构，细菌之间有许多非绿色的黑色区域，呈管道或泡状。
2.4 ISA软件结构定量化分析
对各时间组模型的平均厚度、AP、ADD及TE进行统计，随着培养时间延长，各时间组PAO1菌株BF的平均厚度不断增加，增加程度在前3d比较明显，每个时间组之间增加10μm以上，3d后增加速度减慢，3d组与6d组BF的平均厚度仅增加了6μm(表1)；随着培养时间延长，各时间组模型的AP值呈下降趋势，由最初的0.98下降到0.92；TE值由最初的0.7上升到4.3，增幅接近6倍；ADD值虽然变化幅度不大，但是呈上升趋势(表1)。表1 各时间组PAO1菌株BF的平均厚度、AP、ADD及TE值
3 讨论
细菌BF是一个三维立体空间结构的生态系，是一个具有高度结构性、协调性和功能性的组织群体，BF结构的维持对BF生物学行为具有重要意义。深入认识BF的结构特点，不能停留在某一平面的形态描述，还需要对BF的空间结构展开定量化分析。由于报道基因中常用的绿色荧光蛋白(GFP)的基因具有基因小、性质稳定、对细胞安全等优点，本实验运用电转化方法，成功地将pGFPuv转入PAO1中，建立体外PAO1菌株BF模型，运用CLSM观察以保证细菌BF结构的完整性，连续检测其在玻片表面定植形成BF的过程，结合计算机图像处理分析系统，对BF结构进行定量化分析。
BF形成发展是一个动态过程，生长周期一般分为5个阶段：最初的定植阶段、不可逆黏附阶段、结构分化阶段、发展成熟阶段和解聚再定植阶段［4］。本实验通过CLSM连续动态观察PAO1菌株BF形成，基本反映了这样一个过程：6h左右PAO1菌株开始在玻片表面黏附聚集，1d左右初步形成BF，3d时BF基本形成，具备三维结构，此后BF逐渐发展达到一个平衡，这与文献报道基本一致［5］。随着培养时间延长，BF厚度逐渐增加，但趋势渐缓，可能与BF营养渗透屏障有关。
本实验还采用ISA软件获得了BF空间结构参数的定量化数据，实现了对BF基础结构特征的定量化分析。该软件由美国Montana州立大学的生物膜工程中心2000年开发，采用自动定阈系统［6］，降低了图片处理中主观因素的影响，对BF的二维和三维结构进行更多参数的测定和比较。
ISA提供厚度参数显示，GFP标记的BF模型平均厚度在前3d内增长速度明显快于后3d，提示BF生长速度的不均一性。细菌黏附后初期，BF迅速增厚，但随着时间延长，BF厚度增加趋势减慢，其原因除与营养限制有关外，也可能是BF增加到一定厚度后，为保证底层细菌获得一定的营养物质而维持自身结构，对自身发出密度感应(quorum sensing，QS)信号产生反应，达到平衡状态。
本实验对BF的观察中还发现BF并非一层单纯的致密膜，其内部存在很多黑色相互交通的间隙及孔道，Stoodley等［7］认为这些大、小不一的间隙和通道是BF结构的重要组成部分，其中充满了胞外多糖和蛋白质等营养物质，与深层BF中的细菌生长关系密切。Wood等［8］在牙菌斑BF也发现类似的间隙和通道贯穿于整个BF之中，其功能类似初级循环系统，活菌紧紧围绕在这些孔和通道的周围，保证营养的获取和排除代谢废物。此外，BF还可以借这些通道来感知QS信号。BF这种结构特点决定BF具有一个能适应多种理化变化的内环境。
ISA软件通过区域孔率(AP)和平均扩散距离(ADD)这两个参数，客观反映BF结构发展过程中间隙孔道及营养物质供应距离变化。本实验发现随着培养时间延长，BF厚度逐渐增加，AP逐渐减低，ADD逐渐增加，提示BF逐渐发展，细菌聚集越来越致密，BF结构中间隙及通道的孔径和数目减少，相应营养物质的供应距离增加，细菌物质代谢受到一定限制而将逐渐发展达到一个相对稳态。
BF不仅在结构上存在多样、开放、不均一性特点，而且环境中营养物质、代谢产物、信号分子等物质在BF各个层面也呈现不均一性，使得各层BF菌生理活性及耐药水平也表现出不均一性，最终控制了BF的发展成熟和整体生物学行为。这种不均一性可能是BF的“保护效应(insurance effects)”，是细菌生存的重要策略［9］，它使BF无论受到作用于那个代谢环节的抗微生物因子的攻击，都会有一些细菌存活“重建家园”。ISA软件通过TE参数反映了BF结构发展过程中这种不均一性的变化。实验结果显示随着培养时间延长，TE值逐渐增大，说明在一定范围内，伴随BF发展成熟，BF的不均一度愈来愈强，结构越来越复杂，对外界环境变化的抵抗能力也加强。
ISA软件具有较强的分析功能，根据美国Montana州立大学生物膜工程中心的研究积累发现，平面参数中以AP、ADD最有实用价值，这两个参数能直观地描述BF的结构特点及营养供应情况；而结构参数中以TE最有实用价值，可用于不同BF的比较分析。ISA还能提供FD、MDD、AVRL、AHRL、E、H等参数，但是它们与BF发展的潜在关系尚不明确，有待于进一步验证［10］。
本实验还利用CLSM的三维重建功能对部分模型进行了三维重建，得到了PAO1菌株BF的三维立体图像，图像反映BF是一个多样，开放、不均一的结构，与ISA软件分析结果一致。
需要说明，外源基因表达蛋白质，需消耗宿主细胞的营养物、能量及相关酶等，是宿主细胞的额外负组，可导致重组质粒稳定性降低［11］，而BF中底层细菌营养物质最差，可能影响了GFP的充分表达。Leff等［12］亦报道，在低营养条件下的河水中，GFP质粒可能丢失或不表达。
因此，本实验通过体外建立PAO1菌株BF模型，结合CSLM成功实现了对PAO1菌株BF的原位、动态观察，并利用ISA软件对获得的图片堆进行BF空间结构特点的定量分析，比较客观地说明BF形成过程中空间结构变化，为进一步深入认识细菌BF结构及有效控制细菌BF形成提供新的研究思路和技术平台，这对于临床上控制生物材料相关性感染具有重大意义。
作者：陈波曼 余加林 刘官信 胡琳燕 李芳 杨华《中国抗生素杂志》
【参考文献】
［1］ Bauer T T, Torres A, Ferrer R, et al. Biofilm formation in endotracheal tubes. Association between pneumonia and the persistence of pathogens ［J］. Monaldi Arch Chest Dis,2002,57(1):84～87.
［2］ 单志英，徐海津，施兴启，等. 铜绿假单胞菌最佳电转条件的研究［J］. 遗传学报，2004，31(3)：311～316.
［3］ Beyenal H, Donovan C, Lewandowski Z, et al. Threedimensional biofilm structure quantification ［J］. J Microbiol Methods,2004,59(3):395～413.
［4］ O′Toole G, Kaplan H B, Kolter R. Biofilm formation as microbial development ［J］. Annu Rev Microbiol,2000,54:49～79.
［5］ MaiProchnow A, Evans F, DalisaySaludes D, et al. Biofilm development and cell death in the marine bacterium Pseudoalteromonas tunicata ［J］. Appl Environ Microbiol,2004,70(6):3232～3238.
［6］ Yang X, Beyenal H, Harkin G, et al. Evaluation of biofilm image thresholding methods ［J］. Water Res,2001,35(5):1149～1158.
［7］ Stoodley P, Debeer D, Lewandowski Z. Liquid flow in biofilm systems ［J］. Appl Environ Microbiol,1994,60(8):2711～2716.
［8］ Wood S R, Kirkham J, Marsh P D, et al. Architecture of intact natural human plaque biofilms studied by confocal laser scanning microscopy ［J］. J Dent Res,2000,79(1):21～27.
［9］ Boles B R, Thoendel M, Singh P K. Selfgenerated diversity produces "insurance effects" in biofilm communities ［J］. Proc Natl Acad Sci USA,2004,101(47):16630～16635.
［10］ Beyenal H, Lewandowski Z, Harkin G. Quantifying biofilm structure: facts and fiction ［J］. Biofouling,2004,20(1):1～23.
［11］ Kurland C G, Dong H. Bacterial growth inhibition by overproduction of protein ［J］. Mol Microbiol,1996,21(1):1～4.
［12］ Leff L G, Leff A A. Use of green fluorescent protein to monitor survival of genetically engineered bacteria in aquatic environments ［J］. Appl Environ Microbiol,1996,62(9):3486～3488.
