【摘要】 目的 调查我院2005年临床分离多重耐药铜绿假单胞菌(PA)的耐药性分析并探讨其耐药基因的存在状况。方法 对31株临床分离的铜绿假单胞菌用纸片扩散法检测其药敏表型，采用聚合酶链反应(PCR)法检测β-内酰胺酶编码基因和外膜通道蛋白OprD2基因，并与相关药敏表型比较。结果 31株铜绿假单胞菌对16种抗菌药物的耐药率为48．4%~100%；β-内酰胺酶编码基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的检出率分别为6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未检出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，检出率为100%。结论 本院多重耐药铜绿假单胞菌对β-内酰胺酶类抗生素的耐药主要与外膜通道蛋白OprD2基因缺失有关。
【关键词】铜绿假单胞菌；多重耐药；β-内酰胺酶；聚合酶链反应；基因型
【Abstract】 Objective To survey the distribution of aminoglycoside-modifying enzyme genes in multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa isolated in our hospital in 2005．Methods The antibiotic susceptibility of 31 different antibiotics of P.aeruginosa was tested by K-B method，and 31 multi-drug resistant strains were screened;β-lactamase genes and the outer membrane protein OprD2 gene were detected by polymerase chain reaction(PCR).Results Resistant rates of 31 strains of P.aeruginas against 16 kinds of antibiotic ranged from 48．4%to 100%;the detection rate of β-lactamase gene PER，VIM，DHA，IMP，TEM and OXA-10 was 6．4%，3．2%，3．2%，3．2%，3．2%and 3．2%respectively，and none of the 31 strains possessed genes of GES，SHV and VER，31 isolate of PA lost the outer membrane protein OprD2 gene.Conclusion Resistance to β-lactam compounds in P.aeruginas of our hospital is related to lost the outer membrane protein.
【Key words】Pseudomonas aeruginosa; Multidrug resistance; β-Lactamases; Polymerase chain reaction; Genes
铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是一种重要的条件致病菌，常常引起呼吸道感染、菌血症、肺炎、泌尿系统感染、烧伤感染和囊性纤维化继发感染等多种疾病。2002年全国细菌耐药性监测网调查显示：PA的分离率为10．3%，仅次于大肠埃希菌而居第二位[1]。由于临床上抗生素的大量使用，铜绿假单胞菌呈现出天然或获得性多重耐药性(multidrug resistance，MDR)，给治疗造成困难。近年来，铜绿假单胞菌对3、4代头孢和亚胺培南在内的多种β内酰胺类抗生素及氨基糖苷类抗生素耐药率一直处于一个比较高的水平，并呈现逐年上升的趋势[1-3]。为了解临床分离多重耐药的PA中耐药情况，收集了本院2005年1~12月临床分离的31株PA，对其进行耐药性的检测，并采用分子生物学技术检测其耐药相关基因，结果报告如下。
1 材料
1．1 菌株 来源于本院2005年1~12月临床分离的多重耐药铜绿假单胞菌(MDRP)31株。所有标本均采用法国生物梅里埃公司细菌鉴定仪鉴定菌种。
1．2 质控菌株 大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853均购自卫生部临床检验中心。
1．3 MH培养基 采用英国Oxoid公司产品。
1．4 抗生素及药敏纸片头孢他啶(30 μg/片，CAZ)、头孢曲松(30 μg/片，CRO)、亚胺培南(10 μg/片，IMP)、克拉维酸(2 mmol/L，CA)、氯唑西林(2 mmol/L)、美罗培南(10 μg/片，MER)、2-巯基丙酸纸片均购自英国Oxoid公司。
1．5 微生物鉴定系统 VITEK-32法国生物梅里埃公司产品。
1．6 仪器 DNA扩增仪为美国PE公司产品。
1．7 PCR检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。
2 方法
2．1 细菌培养、鉴定和保存细菌培养根据临床检验操作规程按常规方法进行，采用VITEK-32全自动微生物鉴定系统鉴定结果；将细菌接种于半固体培养基中，37℃培养24 h后置-80℃冰箱保存，以备进行分子学检测。
2．2 抗生素敏感试验采用纸片扩散法(K-B法)，结果根据美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)2004年版标准进行判断。
2．3 PCR扩增模板制备挑取菌落置入含100 μl生理盐水的0．5 ml离心管内，15 000转/min离心5 min，去上清。加0．05%非离子去污剂NP40 50 μl、200 ng/ml的蛋白酶K 2 μl混匀，55℃水浴1 h，然后95℃水浴5 min，最后10 000转/min离心30 s，取上清做PCR扩增的模板。
2．4 基因检测 均为PCR法。PCR扩增产物>500bp热循环参数均为：93℃预变性2 min，然后93℃60 s→55℃60 s→72℃60 s，循环35个周期，最后一个72℃延长至5 min，其余均为：93℃预变性2 min，然后93℃30 s→55℃30 s→72℃60 s，循环35个周期，最后一个72℃延长至5 min。各种靶基因的目的产物长度见表1。
2．5 扩增产物检测 扩增产物在1．5%琼脂糖凝胶(含0．5 μg/ml溴化乙锭)120 V电泳30~40 min，全自动凝胶图像成像仪观察，出现与阳性模板分子量相同的条带即为阳性，PCR检测阳性对照DNA，由无锡市克隆遗传技术研究所微生物DNA收集与保存室提供，扩增条件同上。
3 结果
3．1 药敏试验结果 31株铜绿假单胞菌对16种抗菌药物的药敏率见表2。
3．2 基因检测结果 β内酰胺酶编码基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的检出率分别为6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未检出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，检出率为100%。
4 讨论
研究发现，PA对β内酰胺类抗生素存在多种耐药机制，如外膜渗透性降低、泵出机制、由染色体编码持续高产AmpC酶、产超广谱β内酰胺酶[4]以及能水解卡巴培能碳氢酶烯的金属酶等。IMP是目前用于治疗革兰阴性杆菌感染具有最强抑菌效能的抗生素，对产ESBLs及AmpC酶的革兰阴性杆菌均有效。IMP耐药的PA在临床上具有更大的危险性[5]。
近年来随着研究的深入，国内外学者在PA菌临床分离株中发现了多种β内酰胺酶和碳青霉烯酶基因如TEM[6]、SHV[6，7]、OXA[8]、VEB-1、PER[8，9]、GES、持续高产AmpC酶、IMP[10]、VIM[11]、SPM[12]等。在我国上海、杭州、石家庄、温州相继发现了VEB-1、OXA-10、IMP、PER-1、TEM-1、SHV基因[6，8，10]。这些基因所表达的产物可以水解青霉素类、头孢菌素类、单酰胺类和碳青霉烯类抗生素。
本组菌株中，表型耐亚胺培南的共31株(占100%)，其中外膜通道蛋白OprD2基因缺失为100%；VIM、IPM基因各发现1株，各占3．2%。PA对亚胺培南耐药的主要原因为产IMP、VIM、SPM、GIM型金属β-内酰胺酶、GES-2型β-内酰胺酶和外膜蛋白OprD2缺失等。β内酰胺类抗生素对PA的作用靶位是细菌内膜上的PBP2，该类药物要达到其作用靶位必须首先经过外膜通道进入周浆间隙。如果菌株外膜蛋白通道减少或缺失，药物难以到达其作用靶位，细菌将产生耐药。因此，OprD2被认为是亚胺培南扩散的通道[11]。VIM、IMP是金属β-内酰胺酶，可快速水解青霉素类、头孢菌素类和碳青酶烯类抗菌药物。通过本组实验研究可以表明PA对亚胺培南耐药的主要原因是特异性通道OprD2缺失引起外膜通透性降低，从而阻碍抗菌药物进入菌体内到达细菌作用靶位。
OXA、TEM、SHV、PER、GES阳性均可引起PA对β内酰胺酶类抗菌药物的广泛耐药。本组菌株中PER的阳性率为6．4%，TEM、OXA-10的阳性率为3．2%，而GES、SHV基因未检出，这些基因的阳性率与国内其他地区的检测结果有差别[6，8，10]。导致此种结果出现的原因应与本地区抗菌药物的使用情况有密切关系。
总之，PA的耐药机制极为复杂，它对某一类抗菌药物的耐药往往不是由单一因素造成，而常是几种机制协同作用的结果；它对不同抗菌药物的耐药机制也不完全相同，并不断有新的耐药机制出现。即使是同一种菌不同地区、不同时期其耐药性和耐药基因状况也不相同。本实验结果证明聊城地区的PA对各类抗菌药物均有不同程度的耐药性，且耐药基因阳性率较有报道的国内其他地区高。OprD2基因缺失应该是本组菌株耐药的主要原因，此情况应引起临床医生和院内感染科的高度重视，但也不排除同时存在其他耐药机制的可能，有待进一步研究。
作者：李艳华 高恒强 李鹏 张延强《中国实用医药》
参 考 文 献
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［12］ Poirel L，Magalhaes M，Lopes M，et al.Molecular analysis of metallo-beta-lactamase gene bla(SPM-1)-surrounding sequences from disseminated Pseudomonas aeruginosa isolates in Recife，Brazil.Antimicrob Agents Chemother，2004,48:1406-1409.
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