产AmpC酶的克雷伯菌药敏结果分析及质粒介导的AmpC和ESBLs耐药基因检测

录入时间:2011-2-10 8:42:44 来源：中国论文下载中心

【摘要】目的了解克雷伯菌的耐药性及产AmpC菌株同时产ESBLs药敏的变化。方法采用Vitek 60型和Vitek 32型、纸片扩散法(KB法)测定42株产AmpC酶同时产ESBLs克雷伯菌的药敏结果，并与24株产AmpC酶但不产ESBLs克雷伯菌和138株不产AmpC酶但产ESBLs的克雷伯菌药敏结果对比分析；采用PCR分析产AmpC酶但不产ESBLs肺炎克雷伯菌的AmpC基因型。结果产AmpC不管是否产ESBLs的克雷伯菌对亚胺培南敏感，对其他抗生素均有不同程度的耐药；单纯产ESBLs时，第四代头孢菌素如头孢吡肟对其活性较好，但产AmpC酶同时产ESBLs时，令头孢吡肟几乎失去活性。肺炎克雷伯菌产AmpC酶但不产ESBLs的20株菌中7株检出blaDHA基因，占35%，1株检出blaMIR基因，占5%。另外同时产AmpC酶和ESBLs的20株肺炎克雷伯菌中100%检出blaTEM基因，90%检出blaCTXM1基因，100%检出blaSHV基因，85%检出blaDHA基因，15%检出blaMIR基因，90%检出不同的氨基糖苷类修饰酶基因。结论克雷伯菌产AmpC酶和同时产ESBLs的耐药性比单纯产AmpC酶的耐药性更高、更显著；肺炎克雷伯菌产AmpC酶的主要基因型为DHA，对同时存在2～6种不同类型耐药基因的克雷伯菌，碳青霉烯类药物亚胺培南的体外活性最好。

【关键词】克雷伯菌耐药基因 AmpC ESBLs

ABSTRACT Objective To investigate the drug resistance of Klebsiella and the durg susceptibilitiy variation of ESBLs and AmpC simultaneouslyproducing stains. Methods The drug susceptibility of 42 AmpC and ESBLs producing Klebsiella were detected by KirbyBauer motheds, Vitek 60 and Vitek 32 method. And the results were compared with those of 24 Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs and those of 138 Klebsiella producing ESBLs but nonproducing AmpC. The genotypes of AmpC were identified by PCR. Results All AmpCproducing Klebsiella were susceptible to imipenem and different degree of resistance to other tested antibiotics. The fourth generation of cephlosporin such as cefepime had potent activities to Klebsiella, but had little activity against Klebsiella simultaneouslyproducing AmpC and ESBLs. Of 20 strains of Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs, 7 strains were detected blaDHA gene and 1 strain with blaMIR gene; blaTEMgenes were amplified in 20 strains (100%), blaCTXM1 genes were detected in 18 strains (90%), blaSHV genes were examined in 2 strains (10%), blaDHA genes in 17 strains (85%), blaMIR genes in 3 strains (15%) and three types of AMEsencoding genes were tested in 18 strains (90%). Conclusions The antimicrobial resisitant rates of Klebsiella simutaneoulyproducing AmpC and ESBLs are higher than that to Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs. The genotypes of Klebsiella producing AmpC are mainly DHA type. Imipenem is the first choice of the antibiotics against Klebsiella carrying 2～6 kinds of resistance genes in clinic.

KEY WORDS Klebsiella; Resisitance gene; AmpC; ESBLs AmpC

　　酶是由革兰阴性杆菌产生的能使包括第三代头孢菌素在内的许多β内酰胺酶类抗生素失活的头孢菌素酶，既可由染色体介导，也可以由质粒介导；产ESBLs酶是质粒介导的能水解甲氧氨基β内酰胺抗生素如头孢噻肟、头孢他啶以及氨曲南的β内酰胺酶，它的主要类型是TEM类和SHV类，分别由blaTEM1、blaTEM2和blaSHV1基因发生单个点突变或多个点突变，导致1个或多个氨基酸改变而来［1］。自1983年德国首先发现产ESBLs的肺炎克雷伯菌以来，临床发现产ESBLs的克雷伯菌越来越多，并且同时产AmpC酶和ESBLs的克雷伯菌也时有报道，其耐药机制比较复杂［2］。本文仅从克雷伯菌产AmpC酶和ESBLs的特性与药敏结果的关系进行研究，并进一步对产AmpC酶的质粒进行基因型检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

(1)实验菌株 536株肺炎克雷伯菌、15株产酸克雷伯菌、3株臭鼻克雷伯菌共554株克雷伯菌分离于2000年1月至2005年12月温州医学院附属第一医院和台州市立医院的住院患者，其中来自痰液289株，尿液111株，脓液、创面液、分泌物、胆汁、血液、腹水、穿刺液等标本共154株。经Vitek60与Vitek32全自动细菌分析仪鉴定。同一患者同类标本多次分离到的菌株不重复计入。ESBLs检测质控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603由解放军117医院惠赠；AmpC酶检测质控菌株阴沟肠杆菌029M和阴沟肠杆菌1194E由中国施贵宝公司惠赠。作质粒介导的供AmpC酶的基因检测菌株有20株，为产AmpC酶但不产ESBLs的肺炎克雷伯菌。

(2)仪器与试剂 Vitek60与Vitek32全自动细菌分析仪，GNS506、GNS120药敏检测卡均为法国BioMerieux公司产品，药敏纸片为英国Oxoid公司产品，MH琼脂为浙江杭州天和微生物公司产品。PCR基因扩增试剂盒为无锡市克隆遗传研究所产品，DNA Marker为Fermentas公司提供，琼脂糖凝胶为美国Promega公司产品。

1.2 方法

(1)酶液提取挑取血平板上过夜培养的数个菌落加入12ml胰胨肉汤，置于35℃恒温摇床上(200r/min)孵育4～6h，4℃ 4000r/min离心25min。去沉淀物置-80℃反复冻融5次，1.5ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)漩涡混匀，4℃ 9000r/min离心1h，去上清液即为酶提取液。

(2)ESBLs检测采用酶提取物三维试验。根据ESBLs能水解第三代头孢菌素，但不能被氯唑西林抑制的特点，参考文献［3］操作，按标准纸片扩散法操作，取相当于1.5×108CFU/ml的标准大肠埃希菌ATCC25922菌液，接种MH琼脂平板，平板中心贴一片30μg头孢曲松(CRO)纸片，再距纸片中心5mm放射状切四条狭缝，将40μl的酶提取液加入狭缝内，用36μl酶提取液加上4μl 2mol/L氯唑西林取代40μl的酶提取液加入另一狭缝，余狭缝加阴性和阳性对照，35℃孵育过夜，若狭缝与抑菌环交界处出现生长区域，视为三维试验阳性，即ESBLs阳性。肺炎克雷伯菌ATCC700603为ESBLs阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922、阴沟肠杆菌029M为ESBLs阴性对照。

(3)AmpC酶检测按参考文献［3］操作，将1.5×108CFU/ml的大肠埃希菌ATCC25922菌液密涂于MH琼脂平板，稍干后在平板中心贴一片30μg的头孢西丁纸片。用无菌刀片在离纸片5mm处放射状的切一条狭缝，用微量加样器加样品25μl酶提取液加入狭缝内，避免酶液溢出狭缝，待酶液稍干后置于35℃孵育箱内过夜。若在狭缝与抑菌环的交界处出现扩大的长菌区域，判为三维试验阳性，即AmpC酶阳性。

(4)药敏试验 Vitek60型和Vitek32型全自动细菌分析仪及KB琼脂扩散法检测细菌的药敏结果，严格按照要求操作，并参考CLSI/NCCLS(2004年)标准判断结果。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922。

(5)基因检测

质粒AmpC酶基因检测每反应体系P1、P2引物各0.5μl，Taq DNA酶1U，dNTP、扩增缓冲液、Mg2+等按常规PCR配比加入，总反应体积20μl，其中模板5μl。扩增参数：93℃预变性2min，93℃变性30s，55℃褪火30s，72℃延伸60s，循环35个周期，最后一个循环72℃延长至5min。PCR产物检测经1.5%琼脂糖凝胶电泳(已加入溴化乙锭)，出现与阳性对照分子相当的条带，并与DNA Marker相比较分析，阳性对照DHA为DHA1型阴沟肠杆菌。MIR为MIR型阴沟肠杆菌，纯水为阴性对照。AmpC酶基因PCR扩增使用引物序列见表1。

PCR扩增 PCR引物序列见表2。与ESBLs有关的基因blaCTXM1群引物能扩增CTXM1、3、6、7、10、TOHO1群编码基因，blaCTXM2群引物能扩增CTXM2、4、5群编码基因，blaCTXM3群引物能扩增CTXM 8、9群编码基因。扩增体系为每反应系P1、P2引物各0.5μmol，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 2mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl (pH9.8) 10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%，Taq DNA聚合酶1U。总反应体表1 AmpC酶基因PCR扩增引物表2 ESBLs、AMEs酶基因PCR引物序列积为20μl，其中模板液5μl。与氨基糖苷类修饰酶(AMEs)有关的基因引物aac(3)II、aac(6′)I、ant(3")I与质粒介导的AmpC有关的基因引物blaDHA、blaMIR引物的扩增参数：93℃预变性2min，93℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35个循环。最后一个72℃延长至5min。与ESBLs有关的基因blaTEM、blaCTXM1群、blaCTXM2群、blaCTXM1群、blaSHV、blaPER引物扩增参数为：93℃预变性2min，93℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35个循环，延伸5min。PCR产物检测经1.5%～2%琼脂糖凝胶电泳(已加入溴化乙锭)，出现于阳性对照分子相当的条带，并与DNA Marker相比较分析，纯水为阴性对照。阳性对照CTXM1群为CTXM3型大肠埃希菌，CTXM2群为CTXM5型大肠埃希菌，CTXM3群为CTXM9型大肠埃希菌，SHV为SHV2型大肠埃希菌，PER为PER1型铜绿假单胞菌，DHA为DHA1型阴沟肠杆菌。MIR为MIR阴沟肠杆菌，aac(6′)I为鲍曼不动杆菌(AY536033)，aac(3)II为肺炎克雷伯菌(AY553610)，ant(3")I为鲍曼不动杆菌(AY551438)［4］。

(6)药敏结果统计学处理用SPSS13.0作χ2检验。

2 结果

2.1 克雷伯菌分类及产AmpC酶产ESBLs情况

554株克雷伯菌中肺炎克雷伯菌占96.75%，产酸克雷伯菌占2.71%，臭鼻克雷伯菌占0.54%；产AmpC酶66株，阳性率为11.91%；产ESBLs 180株，阳性率为32.49%，其中既产AmpC又产ESBLs的有42株，阳性率为7.58%。

2.2 产AmpC酶同时产或不产ESBLs菌株的药敏

(1)产AmpC酶同时产ESBLs菌株的药敏结果与产AmpC酶但不产ESBLs菌株的药敏结果见表3。

(2)产AmpC酶同时产ESBLs的药敏结果与不产AmpC酶但产ESBLs的药敏结果见表4。

2.3 基因型

(1)肺炎克雷伯菌产AmpC酶但不产ESBLs 20株检测到产物长度为405bp的blaDHA基因有7株，检出率35%(7/20)，检测到产物长度为302bp的blaMIR基因有1株，检测率5%(1/20)；未检测到其它基因。它们的表型与AmpC基因型见表5。

(2)肺炎克雷伯菌产AmpC酶同时产ESBLs 20株菌β内酰胺类药物的耐药表型和基因型检测结果见表6。

(3)肺炎克雷伯菌产AmpC酶同时产ESBLs 20株菌的AMEs基因型分型见表7。

3 讨论

(1)AmpC酶和ESBLs是介导革兰阴性杆菌耐药的最主要两种酶，它们均能水解第三代头孢菌素，但两者又有重要区别，ESBLs可被β内酰胺酶抑制剂所抑制，不被氯唑西林抑制，且大部分产ESBLs菌对头孢西丁敏感；AmpC酶则不被β内酰胺酶抑制剂所抑制，可被氯唑西林抑制，产酶株对头孢西丁耐药，因此准确检测和区分这两类酶对临床选择用药有重要意义［5］。表3 克雷伯菌产AmpC同时产ESBLs与产AmpC酶但不产ESBLs的药敏结果比较表4 肺炎克雷伯菌产AmpC酶同时产ESBLs株与不产AmpC酶但产ESBLs株的药敏结果比较近年来由于质粒介导AmpC酶的出现［6］，导致耐药性的广泛传播。质粒介导的AmpC酶是1988年由美国发现，它与染色体介导的AmpC酶不同，可以高水平持续表达，可通过转化、接合等方式转移给其它细菌而造成耐药性的广泛传播。除DHA1型外，大多数质粒型AmpC酶是不可诱导的［4，7］。

(2)对于头孢菌素来说，由于产AmpC酶和不产ESBLs阴性的菌株均能水解第三代头孢菌素(如表3所示)，其耐药率都很高(65%～72%)，而产AmpC酶表6 肺炎克雷伯菌产AmpC酶同时产ESBLs对β内酰胺类药物的耐药表型和基因型检测结果表7 肺炎克雷伯菌产AmpC酶同时产ESBLs20株菌的AMEs基因型分型同时产ESBLs的菌株耐药性更高(几乎达100%)；对AmpC酶稳定的头孢吡肟［8］在单纯产AmpC酶的菌株中耐药率达54.2%，在双重产酶株中其耐药率达85.7%。从表3可以看出，产AmpC酶同时产ESBLs菌株的药敏结果，除第一代头孢菌素(如头孢唑林)无差异外，其它耐药率明显高于单纯产AmpC酶的菌株，两者有极显著性的差异。从表4可以看出，当单纯产ESBLs时，头孢吡肟有较好的活性，但当产AmpC同时产ESBLs时，头孢吡肟几乎失去活性。头孢唑林也类似，但头孢曲松、头孢他啶却100%耐药。

(3)从表3还可以看出，AmpC酶几乎不能被含有克拉维酸的酶抑制剂所抑制，但含有三唑巴坦和舒巴坦的酶抑制剂对AmpC酶有一定的抑制作用，这与文献［9，10］报道的结果一致；对氨基糖苷类来说，阿米卡星、庆大霉素对双重产酶株与单纯产AmpC酶菌株的药敏结果无差异，而妥布霉素却有显著差异。妥布霉素对双重产酶株有一定的抑菌作用，但对单纯产AmpC酶菌株效果不佳；对喹诺酮类药物左氧氟沙星、环丙沙星来说，双重产酶株的药敏结果比单纯产AmpC酶菌株效果还好，两者有显著性差异，其中原因需进一步研究。

(4)对于碳青霉烯类亚胺培南，不管是否产AmpC酶还是产ESBLs酶，它的耐药率总为0，所以说碳青霉烯类是治疗产AmpC酶和ESBLs的克雷伯菌的首选药物，并且是最好的药物；对头霉素药物头孢替坦等，虽然它们的耐药率也很低，但由于它们有很强的诱导DHA型质粒AmpC酶的作用，临床也很少选用。

(5)对产AmpC酶但不产ESBLs的肺炎克雷伯菌的ampC基因检测的结果来看，blaDHA基因是肺炎克雷伯菌的产AmpC酶的主要基因。对20株产AmpC酶和同时产ESBLs的肺炎克雷伯菌耐药基因检测，75%菌株同时检测到ESBLs基因型TEM、CTXM1及AmpC基因型DHA；20株菌中100%菌株检测到基因型TEM，10%菌株检测到ESBLs基因型SHV、DHA，90%检测到CTXM1，15%检测到MIR，提示在浙江的温州和台州地区存在基因型TEM、CTXM1 ESBLs和DHA基因型AmpC流行。

作者：王冬国周铁丽《中国抗生素杂志》

【参考文献】

［1］ Dubois S K, Marriott M S, Amyes S G. TEMandSHVderived extendedspectrumbetalactamases: Relationship between selection, structure and function ［J］. J Antimicrob Chemother,1995,35:7

［2］王林峰，王选锭. 肺炎克雷伯菌耐药机制研究进展［J］. 中国抗生素杂志，2004，29(6)：324

［3］ Coudron P E, Moland E S, Thomson K S. Occurrence and detection of AmpC betalactamase among Escherichia coli, Klebsiella pnemoniae, and Proteus mirabilis isolates at a veterans medical center ［J］. J Clin Microbiol,2000,38:1971

［4］ Bradford P A, Urban C, Mariano N, et al. Imipenem resistance in Klensiella penumoniae is associated with the combination of ACT1, a plamid mediated AmpC beta lactamase, and the loss of an outer membrance ［J］. Antimicrob Agent Chemother,1997,41:563

［5］周铁丽，陈俐丽，潘钦石，等. 革兰阴性菌中超广谱β内酰胺酶和AmpC酶的检测分析［J］. 温州医学院学报，2003，33(6)：87

［6］ Bauernfeind A, Chong Y, Lee K. Plasmidencoded AmpC betalactamases: How far have we gone 10 years after the discovery ［J］. Yonsei Med J,1998,39(6):520

［7］王琴，杨萍，胡静仪，等. 60例肺炎克雷伯菌多重耐药性及主要耐药基因的研究［J］. 天津医药杂志，2005，33(2)：339

［8］周铁丽，陈晓东，王忠永，等. 鲍曼不动杆菌超广谱β内酰胺酶、AmpC酶检测及耐药性分析［J］. 温州医学院学报，2005，35(4)：303

［9］ Bou G, MartinezBeltran J. Cloning, nucleotide sequeening, and analysis of gene encoding an AmpC betalactamase in Acinetobacter baumannii ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(2):428

［10］ Livermore D M. Determinants of the activity of betalactamase inhibitor combinations ［J］. J Antimicrob Chemother,1993,31(Suppl A):9

上一篇：产志贺毒素大肠埃希菌产超广谱β内酰胺酶基因型的研究

下一篇：厚朴内生真菌的研究（Ⅰ）：菌种分离及其鉴定

相关文章:

头孢吡肟对质粒介导产AmpC β-内酰胺酶大肠埃希菌的接种效应研究