金黄色葡萄球菌食物中毒病原检测及方法比较

［摘要］目的：可疑金黄色葡萄球菌食物中毒事件病原学检测，传统的分离培养与荧光PCR检测方法的方法比较 。方法：本实验采用国家标准方法对食物中毒标本进行金黄色葡萄球菌分离培养，并对食物中毒标本及分离的阳性菌株作肠毒素定性测定；用荧光PCR(FQPCR)方法对可疑食品及患者呕吐物标本进行金黄色葡萄球菌快速检测。 结果：用国标方法，9份呕吐物标本中7份分离出金黄色葡萄球菌，阳性率77.78%，荧光PCR快速法检测相同标本，9份呕吐物均呈阳性，阳性率100%，食品卤香干检出金黄色葡萄球菌，8个阳性菌株C型肠毒素检出率100%。结论：该中毒确诊为金黄色葡萄球菌C型肠毒素中毒，中毒食品为卤香干。荧光PCR检测法快速、灵敏，尤其适用于药后患者标本及已加热杀菌的可疑中毒食品的检测，作为初筛、辅助诊断手段，在食物中毒病原检测中值得广泛推广。

 

　　［关键词］  金黄色葡萄球菌；肠毒素；病原诊断；溯源

 

　　金黄色葡萄球菌是国内外最常见的细菌性食物中毒病原之一，在我国，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒约占细菌性食物中毒事件的25%，而在美国、加拿大等发达国家，更是高达50% 。该菌引起中毒的主要原因是产生耐热肠毒素，100　℃加热1.5 h仍不失去其活性［1］。因此，金黄色葡萄球菌一旦污染食品并在其产生肠毒素，普通的烹饪方法不能将其破坏，因而食品一旦被金黄色葡萄球菌污染极易引起食源性疾病的爆发。2005年8月，我市也发生了一起由于食用从某大型超市购买的卤菜而引起的食物中毒，中毒24人，经现场流行病学调查、患者临床症状及实验室病原诊断，证实为一起金黄色葡萄球菌肠毒素中毒。现将病原检测情况报告如下。

 

　　1　材料与方法

 

　　1.1　标本　患者呕吐物9份，可疑中毒食品凉拌豆笋、卤鸭掌、卤香干各1份，分别编号1～12。

 

　　1.2　实验设备、检测试剂及培养基　荧光PCR仪(美国MJ opticon2)、金黄色葡萄球菌DNA检测试剂盒(达安基因提供)、金黄色葡萄球菌肠毒素RPLA(反相被动胶乳凝集实验)试剂盒(OXOIDTD0900)、7.5%氯化钠肉汤、胰蛋白胨大豆肉汤、BairdPark琼脂、血琼脂、冻干兔血浆、微量甘露醇发酵管。所有试剂及培养基均在效期内使用，实验室室内质控和室间质评均符合要求。

 

　　1.3　菌株分离　按国标方法［2］称取25 g检样加入225 ml灭菌生理盐水中，均质器混匀后吸取5 ml接种于50 ml 7.5%氯化钠肉汤36 ℃±1 ℃增菌24 h，转种BairdPark(BP)琼脂36 ℃±1 ℃培养24 h后，挑取可疑菌落染色镜检、转种血琼脂平皿及做血浆凝固酶实验、甘露醇发酵实验。金黄色葡萄球菌在BP琼脂上形成圆形、光滑、突起、湿润的灰黑色菌落，菌落周围有一浑浊带，外层有一透明圈。

 

　　1.4　金黄色葡萄球菌DNA定性检测　依试剂盒说明，0＜Ct≤35判阳性，Ct=0为阴性。

 

　　1.5　肠毒素检测　将分离得到的菌落接种至胰蛋白胨大豆肉汤36 ℃±1 ℃培养18 h～24 h，患者呕吐物标本、可疑中毒食品可直接取样10 g加入10 ml生理盐水，均质器混匀，900 g、4 ℃离心20 min，取上清用0.25 μm～0.45 μm微孔滤膜过滤，保留滤液作反相被动胶乳凝集实验(RPLA)，检测A、B、C、D四型肠毒素。

 

　　2　结果与分析

 

　　12个标本检测结果见表1。

 

　　表1　12个标本各项检测结果(略)

 

　　注：标本4、6为用药1天后患者标本＋：阳性-：阴性±：可疑

 

　　2.1　FQPCR快速金黄色葡萄球菌　样品中直接提取DNA9份呕吐物标本阳性率100%，3份可疑中毒食品中12号卤香干DNA检测呈阳性。从样品处理至出初步结果历时约4 h。

 

　2.2　分离培养法　9份呕吐物标本7份分离金黄色葡萄球菌，阳性率77.78%，可疑中毒食品卤香干亦分离出金黄色葡萄球菌。

 

　　2.3　肠毒素检测与分型

 

　　2.3.1　直接从样品中检测肠毒素　3份呕吐物标本及卤香干检出C型肠毒素。

 

　　2.3.2　阳性菌株接种产毒培养基增菌后检测肠毒素　7份呕吐物和卤香干中分离的8株阳性菌C型肠毒素检出率100%。

 

　　3　讨论

 

　　3.1　建立快速、准确诊断食物中毒病原菌的检测方法是有效控制食物中毒的重要手段　目前，国内金黄色葡萄球菌食物中毒病原诊断的金标准仍然是细菌的成功分离，通过增菌、分离培养、生化鉴定等一系列步骤来完成，灵敏度低，操作较烦琐，耗费时间长。应用荧光PCR技术则弥补了这个缺点，灵敏、快速、特异、操作简单［3］，尤其适用于无活菌或含菌量低的用药后患者标本及已加热杀菌的可疑中毒食品的检测。本次实验结果显示，FQPCR检测金黄色葡萄球菌的阳性率与分离培养法的阳性率有较好的伴随关系，检测时间由传统方法的4 d缩短到4 h，证明荧光PCR检测结果可信、快速，但正因为其高度的敏感性，而外环境中金黄色葡萄球菌的普遍存在，使检测过程中易受外环境的污染而造成假阳性，所以只有结合两种方法的优点，把常规培养法与FQPCR法相结合，把荧光PCR技术作为初筛、辅助诊断手段，为早期诊断及最后确诊病原指明方向，避免在检测中犯方向性错误而浪费更多的时间延误诊断。

 

　　3.2　金黄色葡萄球菌中毒的实质是耐热肠毒素中毒，只有检测出肠毒素，才能为金黄色葡萄球菌中毒下最后的定义［4］，实验结果显示：RPLA直接检测标本中金黄色葡萄球菌肠毒素不够灵敏，最好将分离到的阳性菌株接种到产毒培养基(胰蛋白胨大豆肉汤等)36　℃±1　℃培养18 h~24 h再行检测。

 

　　3.3　另外，本实验室在用BP琼脂选择性培养金黄色葡萄球菌时，因晚上停电(停电时段不明)，温箱内温度降低，培养24 h后观察菌落时，形态特征不明显，“菌落周围有一浑浊带及外层有一透明圈”这一典型鉴别特征不清晰，放回温箱36 ℃±1 ℃继续培养约4 h后，才出现典型特征。可见，在金黄色葡萄球菌分离培养中，培养温度和时间一定要充分达到要求，否则容易漏检。

 

　　3.4　本次食物中毒从病原学角度可诊断为金黄色葡萄球菌　C型肠毒素中毒，中毒食品为本市某大型超市出售的散装凉菜卤香干。当前，食源性疾病已越来越受到各级政府的高度关注，作为控制食源性疾病主力军的卫生监督、疾控部门，应加大监管力度，从根本上着手，坚决打击取缔不顾公共食品安全的不法商贩、地下黑作坊，防止危害公共健康的食源性疾病的发生。

 

　　参考文献:

 

　　［1］　张文治.新编食品微生物学［M］.北京：中国轻工出版社，1995.

　　［2］　GB/T4789.102003，食品卫生微生物学检验［S］

　　［3］　张蓓，沈立松.实时荧光定量PCR的研究进展及其应用［J］.国外医学临床生物化学与检验册，2003，24(6):327328.

　　［4］　雷祚荣.葡萄球菌和葡萄球菌毒素病［M］. 北京：中国科学技术出版社，1992.