肺炎克雷伯杆菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制

肺炎克雷伯菌为G - 球杆形，无鞭毛，有较厚的荚膜，多数菌株有菌毛，营养要求不高，在普通培养基上生长的菌落大，呈黏液状，以接种环挑之易拉成丝为特征有助于鉴别［1］ 。是人类呼吸道和肠道的常见病，也是重要的条件致病菌，可引起呼吸道、泌尿道、肠道感染、血液、手术切口、皮肤软组织等多个部位感染，近年来肺炎克雷伯菌感染有明显增加的趋势，并且成为革兰阴性杆菌和医院内感染的主要致病菌之一。由于各种抗菌药物的广泛使用导致肺炎克雷伯菌对以β-内酰胺类抗生素为主的多种抗菌药物产生耐药性，常可以引起各种难治性感染。

   

　　细菌对β-内酰胺类抗生素耐药机制包括:①质粒介导或染色体突变产生β-内酰胺酶破坏β-内酰胺环，灭活抗生素。②改变细菌外膜蛋白，降低抗生素的通透性，阻碍其进入内膜靶位;③抗生素靶位的修饰，或是改变青霉素结合蛋白（PBPs）数量，或是降低药物与PBPs的亲和力，肺炎克雷伯菌的PBPs与大肠杆菌的PBPs相似，但目前尚未在临床菌株中发现由PBPs介导的这类细菌耐药性。肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗生素的耐药机制主要是通过产生β-内酰胺酶破坏抗生素，降低细胞膜对抗生素的通透性及形成生物膜的群体作用。

 

　　1 产酶

   

　　1.1 β-内酰胺酶

   

　　1.1.1 广谱β-内酰胺酶 革兰阴性杆菌产生的β-内酰胺酶是细菌耐药的主要机制之一。广谱β-内酰胺酶属功能分类法2b组，分子分类法的A类，包括SHV-1、TEM-1及TEM-2等类型肺炎克雷伯菌主要是产SHV-1型酶。肺炎克雷伯菌可以产生几乎所有类型的β-内酰胺酶，根据其决定基因的数量、编码、传导和表达方式，将β-内酰胺酶主要划分为染色体介导的诱导酶和质粒编码的其他类型的β-内酰胺酶，其中的后者在耐药性表达方面尤为重要。随着头孢菌素类抗生素的广泛应用，临床分离的肺炎克雷伯菌产广谱β-内酰胺酶越来越普遍，而且渐渐衍生出耐药性很强的超广谱β-内酰胺酶。

   

　　1.1.2 超广谱β-内酰胺酶（ESBLs） ESBLs是由革兰阴性杆菌产生的最重要一类β-内酰胺酶，属功能分类的2be组，分子分类的A类，其分子基础常是质粒介导的β-内酰胺酶基因的点突变导致的相应酶上一个或多个氨基酶改变，是最新一代的抗生素选择压力的结果。1983年最先在德国发现一株肺炎克雷伯菌临床分离株可以产生一种质粒介导的β-内酰胺酶 ［2］ ，氨基酸序列分析显示是由于SHV-1在238位点发生甘氨酸到丝氨酸的突变所致，这种酶称为SHV-2，随后，在临床分离了肺炎克雷伯菌中发现了SHV-5、SHV-12、SHV-13、SHV-14、SHV-16、SHV-18、SHV25-27等SHV型ESBLS ［3］ 和TEM-47、TEM-48、TEM-49等TEM型的ESBLS ［4］ ，以及CTX-M-12、CTX-M-14、CTX-M-17、PER-2、VEB-1等非SHV、TEM型ESBLS ［5～6］ 。这些突变酶的水解底物谱较广，能有效水解青霉素类，一至三代头孢菌素类和氨曲南，一部分甚至水解第四代头孢菌素类。碳青酶烯类和头霉素类。

    

　　肺炎克雷伯菌产ESBLs率较高，国外报道［7］ 产酶率约10%～40%。最近黎巴嫩一家大型医院临床分离的1248株肺炎克雷伯菌中20%产ESBLS。以ICU分离出的菌株产ESBLS率最高，为38.4%。国内报道产ESBLS率亦在20%～50%之间，且近年报道产酶率多在40%以上，华山医院报道 ［8］ ICU等科室分离出的肺炎克雷伯菌产ESBLS率高达51%。国内研究报道肺炎克雷伯菌临床分离菌株中ESBLS以CTX-M基因型为主，其主要水解底物为头孢塞肟，但对头孢他啶水解率很低。

   

　　1.1.3 头孢菌素酶（AmpC） sAmpC酶是革兰阴性杆菌产生的又一类重要的β-内酰胺酶，属功能分类法的Ⅰ组，分子分类法的C类，编码AmpC酶的基因常发现在肠杆菌科，包括肠杆菌属、志贺菌属、普罗威登斯菌属和大肠埃希菌属的染色体上。

   

　　1988年美国Rhode岛院内感染流行，从这些院内患者身上分离出一株肺炎克雷伯菌，此菌株产生的β-内酰胺酶是有Bush I类酶的生化特性，其基因与阴沟杆菌的染色体AmpC基因是有90%同源性，对第二代头孢菌素、头酶素及酶抑制剂复合物均耐药，且这种耐药性可传递，后来被确认为质粒介导的AmpC酶，命名为MIR-1 ［9］。肺炎克雷伯菌产生的AmpC酶有ACT-1、MOX-1、CMY-2、FOX-1、ACC-1、MOX-2、DHA-1等［10～12］ 。Ampc酶在临床上是有重要意义，因为它们对临床上广谱的β-内酰胺类抗生素包括三代头孢菌素、单环酰胺类、头酶素类等β-内酰胺类抗生素氨曲南等具有耐药性，且不受临床常用的β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦、三唑巴坦抑制，但对四代头孢和碳青霉烯敏感。Cao ［13］ 等研究证明，由质粒介导的Ampcβ-内酰胺酶如ACT、或CMY-4结合外膜蛋白缺失，可产生对碳青酶烯类如亚胺培南耐药。Yan ［14］ 等新发现的CMY-8，其核苷酸和氨基酸序列分析显示与MOX-1与CMY-1具有同源性，它们都对头孢塞肟和头孢西丁呈现高度耐药性。

 

　　1.1.4 耐酶抑制剂β-内酰胺酶 耐酶抑制剂β-内酰胺酶于1989年在大肠埃希菌中首先发现，属功能分类法的2br类，分子分类法的A类，此类酶除SHV-10及OHIO-1以外均为TEM型β-内酰胺酶。1995年法国Lemozy等 ［15］首次发现两株肺炎克雷伯菌对阿莫西林/克拉维酸耐药。而对头孢噻吩完全敏感，通过分子生物学鉴定为产IRT-1，IRT-2型β-内酰胺酶菌株，随后Girlich等 ［16］ 报道法国一家医院老年病房192位患者身上可分离出对阿莫西林与克拉维酸的复合制剂耐药的肺炎克雷伯菌，其中11株分子生物学鉴定为产IRT-2型β-内酰胺酶，其编码基因位于质粒上，提示产耐酶抑制剂β-内酰胺酶的肺炎克雷菌可能导致医院内感染的爆发。一般而言，产耐酶抑制剂β-内酰胺酶可导致肺炎克雷伯菌对青霉素类、以及青霉素类与β-内酰胺酶抑制剂克拉维酸、舒巴坦的复合制剂的耐药性，但对头孢菌素类及青霉素类与三唑巴坦的复合制剂敏感，此类酶不被克拉维酸和舒巴坦所抑制，却可以被三唑巴坦抑制。目前国内外肺炎克雷伯菌产生此类酶的报道不多。

   

　　1.1.5 碳青霉烯酶 碳青霉烯类抗生素是具有广谱抗菌活性的β-内酰胺酶类抗生素，具有抗头孢菌素诱导酶，抗TEM和SHV型超广谱酶等优点。是治疗效果比较理想的抗感染药。但由于广泛应用，目前已出现了能水解碳青霉烯类的β-内酰胺酶。碳青霉烯酶分二组:一组为非金属碳青霉烯酶。2001年Yijit ［17］在肺炎克雷伯菌中发现属于Bush分类法的功能分类2f群，分子分类A群，但与Sme-1仅有45%同源性的KPC-1对碳青霉烯类，头孢菌素类呈现高度耐药;而大多数碳青霉烯酶属另一组即金属酶，属功能分类法的3组，分子分类法的B组。1991年在日本发现IMP-1后，全球有陆续报道，主要分布在铜绿假单胞菌和粘质沙雷菌。到目前为止，碳青霉烯酶在肺炎克雷伯菌中发现不多。近来Poirel报道 ［18］ 一株肺炎克雷伯菌产生染色体编码的SHV-38型β-内酰胺酶可水解亚胺培南，SHV-38和SHV-1氨基酸序列146位缬氨酸被丙氨酸所取代而成的衍生物，这是第一株SHV型的β-内酰胺酶可水解碳青霉烯类的报道。产碳青霉烯酶可导致肺炎克雷菌对碳青霉烯类、青霉素类、广谱头孢菌素及单环类等抗生素的耐药性，由于目前产碳青霉烯酶临床菌株相对少见，碳青霉烯类仍可作为临床难治性感染的有效治疗选择，但碳青霉烯类的广泛使用有可能导致碳青霉烯酶的产生、流行，而其中的金属酶因不被临床常用酶抑制剂所抑制，造成了威胁将很大，应引起足够重视。

   

　　2 外膜孔蛋白缺失

   

　　虽然大多数情况下，外膜孔蛋白缺失不是主要的耐药机理，但它可降低细菌对抗生素的敏感性，在其它的耐药机理存在的情况下，可明显提高耐药程度。多数β-内酰胺类抗生素外膜孔蛋白通透率较低，一旦外膜孔蛋白缺失或减少就会造成抗生素进入细菌细胞内的量大减，引起耐药而氨基糖甙等尚有其它通道进入胞内，故受影响不大，所以外膜孔蛋白缺失造成的耐药性主要与β-内酰胺类抗生素有关。孔蛋白缺失与抗生素的耐药性关系在革兰阴性杆菌中已有报道，然而导致孔蛋白缺失和随后产生抗生素耐药的机理目前尚未完全清楚。插入序列（IS）与某些抗生素的耐药性有关。通过产生新的耐药 基因启动子，但IS插入孔蛋白基因引起抗生素的耐药由Herndndez Alles等 ［19］ 首次报道。产ESBL的肺炎克雷伯菌在孔蛋白的OMPK36和OMPK35降低或缺失时，能增加对头孢西丁和头孢菌素类的耐药性。OMPK36基因突变包括点突变、小片段缺失，整个基因缺失或插入。可最常见的基因突变是插入，以发现4种不同的插入序列（IS26、IS5、IS903和IS1）定位在OMPK36基因的不同位置，孔蛋白基因上IS的插入能干扰或改变基因表达，引起的肺炎克雷伯菌的孔蛋白缺失，导致对β-内酰胺类抗生素耐药。

   

　　目前公开报道的与肺炎克雷伯菌耐药性有关的孔蛋白中多数抗性蛋白是孔蛋白OMPK36和OMPK35。西班牙Hernandez Alles ［15］ 报道利用插入序列干扰肺炎克雷菌OMPK36孔蛋白合成造成外膜OMPK36孔蛋白缺失，导致肺炎克雷伯菌对头孢西丁的耐药增加，较好地证实了外膜孔蛋白缺失可直接导致肺炎克雷伯菌产生耐药性。外膜孔蛋白缺失协同AmpC类β-内酰胺酶时耐药程度较β-内酰胺酶单独作用时更高。

 

　　3 细菌生物被膜形成

   

　　细菌在生长过程中通过鞭毛或其附着结构牢固地附着于固体表面，进行生长、分裂和繁殖，同时其他游走性细菌继续附着，导致该位点的细菌生长环境极度拥挤，有毒的代谢物堆积，许多细菌得不到营养。在这种竞争压力下，细菌启动细胞间信号，经信号系统的调节，细菌一边分泌胞外多糖Eps，一边从固体表面轻轻地移动，最终形成多细菌蘑菇样或柱体亚单位，多个亚单位形成成熟的细菌生物被膜，生物被膜是细菌的特殊存在形式。

   

　　最近研究发现，生物被膜是肺炎克雷伯菌产生耐药性的重要机制之一。目前认为对β-内酰胺类抗生素而言肺炎克雷伯菌生物被膜耐药机制可能有:①在生物被膜环境中，细菌表面改变，抗生素作用位点消失，或作用位点存在，但抗生素无法作用。②生物被膜中细菌分泌的碳氢化合物被膜和抗生素降解酶如β-内酰胺酶合成，可阻止抗生素穿入。③生物被膜中的细菌由于营养限制导致低生长率，并以静止状态长期存在，这使得仅杀伤分裂状态细菌的抗生素对其难以发挥作用。An-derl等 ［20］ 报道用10倍MIC浓度的氨卞西林处理浮游生长及生物被膜状态的肺炎克雷伯菌，因为生物被膜阻止了氨卞西林渗入而导致生物被膜状态的肺炎克雷伯菌产生耐药性。即细菌生物被膜状态比浮游状态对抗菌药物的耐药性明显增升，呈现细菌群体耐药形成。另有报道生物被膜还有可能因为接触抗菌药浓度低，较浮游生长菌有更多机会被诱导产生β-内酰胺酶而引起耐药等等目前尚无定论，有待进一步的研究。

 

　　4 主动外排的机制

   

　　主动外排系统与细菌形成多重耐药性有关。由于这种系统的转运底物大多非常广泛，而且同一株细菌可存在多种主动外排系统，因此可导致细菌产生对各种结构完全不同的抗菌药物的耐药即多重耐药。

   

　　肺炎克雷伯菌对β-内酰胺类抗生素的耐药往往不是由单一因素造成的。细胞胞膜通透性降低和β-内酰胺酶产生之间发生协同作用;细菌群体的生物膜耐药与多种耐药机制有关;尤其是产ESBL耐药基因质粒的广泛传播加速了多种耐药的产生。故加强肺炎克雷伯菌分离株的耐药监测，分析总结其耐药规律和特点，有助于指导临床合理应用抗生素。为设计针对耐药机制并具有高浓度抗药活性的新一代β-内酰胺类抗生素提供依据。

 

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