幽门螺杆菌相关性胃炎中核因子κB与IL8表达的意义及关系

Expression of NFκB and interleukin8 in helicobacter pyloriassociated gastritis

 

　　CAO Ping, LU QiMing, ZHANG XiuLan

 

 

　　1School of Clinical Medicine, Lanzhou University, 2Department of Gastroenterology, Peoples Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China

 

 

　　【Abstract】 AIM: To investigate the relation and distribution of expressions of nuclear factorκB (NFκB) p65 protein and interleukin8 (IL8) in helicobacter pyloriinfected gastric mucosa. METHODS:  Gastric mucosal biopsy specimens were obtained respectively from 38 patients with H.pyloripositive gastritis and 18 H.pylorinegative control subjects. The expressions of NFκB p65 protein, IL8 mRNA and protein were determined by immunohistochemistry and in situ hybridization. RESULTS:  The expressions of p65 protein, IL8 mRNA and protein were significantly higher in H.pyloripositive gastric mucosa than those in H.pylorinegative controls (5.7±3.3 vs 3.0±2.5, 3.7±2.6 vs 1.1±1.3, 4.0±3.0 vs 1.9±1.6, P<0.01) and they were correlated with the histological severity of activity, inflammation and H.pylori density (P<0.05). The expression of p65 significantly was correlated with that of IL8 mRNA and protein (P<0.01). There was a positive correlation between IL8 mRNA and IL8 protein (P<0.01). CONCLUSION:  H.pylori infection leads to the overexpression of NFκB p65 and IL8 in the gastric mucosa. NFκB activation may contribute to IL8 gene transcription and is involved in the pathological process of H.pyloriassociated gastritis.

 

 

　　【Keywords】 nuclear factorκB; interleukin8; Helicobacter pylori;  chronic gastritis

 

 

　　【摘要】 目的：探讨幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）感染时胃黏膜中核因子κB（NFκB）和白细胞介素8（IL8） mRNA及蛋白的表达关系和分布. 方法： H.pylori阴性慢性胃炎18例和H.pylori阳性慢性胃炎患者38例，胃黏膜活检标本采用免疫组化法和原位杂交法检测NFκB p65蛋白、IL8 mRNA及蛋白的表达. 结果：H.pylori阳性慢性胃炎组胃黏膜中NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白的表达较H.pylori阴性组显著增强（5.7±3.3 vs 3.0±2.5, 3.7±2.6 vs 1.1±1.3, 4.0±3.0 vs 1.9±1.6, P<0.01），三者的表达均与胃黏膜慢性炎症程度密切相关（rs分别为0.536,0.474和0.537, P<0.01），与炎症活动性也呈正相关（rs分别为0.575,0.357和0.469, P<0.05），同时与H.pylori密度之间具有显著相关性（rs分别为0.702,0.614和0.713, P<0.01）； p65蛋白表达与IL8 mRNA和蛋白的表达均呈正相关关系（rs分别为0.666,0.682，P<0.01）. 结论：H.pylori感染导致胃黏膜NFκB p65和IL8的表达增加，NFκB可能通过调控IL8基因转录，参与了H.pylori相关性胃炎的病理生理过程.

 

 

　　【关键词】 核因子κB；白细胞介素8；幽门螺杆菌；慢性胃炎

 

 

　　0引言

 

 

　　核因子κB（nuclear factorκB, NFκB）是一类具有多向性转录调节作用的核蛋白因子，广泛参与多种基因特别是免疫炎症反应相关基因的表达调控，在机体的免疫应答、炎症反应、细胞生长分化和凋亡等方面发挥着重要作用［1-4］. 已知白细胞介素8（interleukin8,IL8）是幽门螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）相关胃炎症反应的主要介质［5,6］，因此我们在原位观察H.pylori相关性胃炎胃黏膜中核因子κB p65蛋白和IL8 mRNA及蛋白的表达和细胞定位，并分析它们之间的关系，探讨NFκB在H.pylori致病机制中的作用.

 

 

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　经胃镜及病理组织学检查证实的慢性胃炎56(男35，女21)例，年龄18～70（平均41）岁，其中H.pylori阴性18例，H.pylori阳性38例. H.pylori诊断采用快速尿素酶试验和改良Giemsa染色，2项结果均阳性诊断为H.pylori阳性，2项结果均阴性诊断为H.pylori阴性，一阴一阳不列入本研究. 两组间在性别、年龄的构成上无显著性差异，所有研究对象受检前4 wk内均未接受抗生素、铋剂、H2受体拮抗剂、质子泵抑制剂和糖皮质激素治疗. 内镜检查时每例研究对象均于距幽门2~3 cm胃窦大小弯取活检标本4块，1块用于快速尿素酶试验，另3块用于病理组织学检测、免疫组织化学染色和原位杂交染色，内镜活检标本经甲醛固定石蜡包埋，4 μm厚度连续切片备用，作常规HE染色和改良Giemsa染色以确定病理组织学和H.pylori诊断. 根据悉尼系统胃炎分类标准，将慢性炎症、活动性、萎缩、肠化和H.pylori密度分别分成0，1，2，3级.  鼠抗人NFκB p65 mAb和兔抗人IL8多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;免疫组织化学染色试剂盒（SP即用型）、DAB显色剂和柠檬酸抗原修复液购自福州迈新公司;IL8 mRNA原位杂交试剂盒和焦碳酸二乙酯购自武汉博士德公司.

　　1.2方法

　　免疫组织化学染色的组织切片脱蜡至水后，微波修复抗原，继以免疫组化SP法染色（步骤按说明书进行），DAB显色，苏木素复染，封片. 一抗工作液稀释浓度为：NFκB p65 1∶100；IL8 1∶200. 用PBS替代一抗作阴性对照，用已知阳性切片作阳性对照. 原位杂交染色的组织切片脱蜡至水，30 mL/L H2O2室温处理10 min以灭活内源性酶；胃蛋白酶消化10 min，暴露核酸片段；滴加预杂交液，40℃ 4 h；加IL8寡核苷酸探针杂交液，40℃杂交过夜；加封闭液37℃ 30 min；滴加生物素化鼠抗地高辛37℃ 60 min；加SABC 37℃ 20 min；滴加生物素化过氧化物酶37℃ 20 min；DAB显色，苏木素复染，封片. 用预杂交液替代探针作阴性对照. 以胞质或胞核出现棕黄色颗粒为NFκB p65阳性表达细胞，以胞质出现棕黄色颗粒为IL8 mRNA和蛋白阳性表达细胞. 每张切片随机观察10个高倍视野，采用统一的染色积分评价标准，按染色强度分为4级：0,阴性染色;1,弱阳性染色;2,中度阳性染色;3,强阳性染色；按阳性细胞数占总细胞数的比例分为5级：0,阴性;1,阳性细胞占1%～25%;2,阳性细胞占26%～50%;3,阳性细胞占51%～75%;4,阳性细胞占76%～100%. 每张切片的染色积分以这二者乘积之和表示.

　　统计学处理： 染色积分以x±s表示，应用SPSS 10.0统计分析软件包进行统计学处理，采用秩和检验和Spearman等级相关分析，P<0.05认为差异有统计学意义.

　　2结果

　　2.1NFκB p65蛋白和IL8 mRNA及蛋白的细胞定位p65蛋白主要表达于胃窦黏膜表面上皮和固有腺上皮细胞，亦散在表达于固有层炎性细胞（主要为单核细胞和淋巴细胞），且在H.pylori阴性胃黏膜中阳性染色主要在胞质中，少数有胞核着色，而H.pylori感染胃黏膜中则胞质胞核均有阳性染色，与H.pylori阴性组比较胞核着色明显增加. IL8 mRNA和蛋白均表达在胃窦黏膜表面上皮和固有腺上皮细胞以及固有层单核细胞的胞质中.

 

 

　　2.2H.pylori感染与胃黏膜NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表达的关系H.pylori阳性胃黏膜中NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白的表达较H.pylori阴性组显著增强(P<0.01，Tab 1)，且三者的表达均与H.pylori密度之间具有明显相关性（rs分别为0.702,0.614和0.713, P<0.01）.表1两组患者胃黏膜NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表达的比较（略）

　　2.3H.pylori阳性胃黏膜NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表达与胃黏膜炎症程度的关系NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白的表达与胃黏膜慢性炎症程度密切相关（rs分别为0.536,0.474,0.537，P<0.01），同时也与炎症活动性的程度呈正相关（rs分别为0.575,0.357和0.469，P<0.05），但与萎缩和肠化的程度无相关性(Tab 2).表2NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表达与胃黏膜炎症程度的关系（略）

　　2.4H.pylori阳性胃炎黏膜中NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表达之间的关系经Spearman等级相关分析发现，胃黏膜NFκB p65蛋白表达与IL8 mRNA和蛋白的表达均呈正相关关系(rs分别为0.666,0.682，P<0.01)，IL8 mRNA与其蛋白的表达亦显著相关(rs为0.586，P<0.01).

 

 

　　3讨论

 

　　我们发现，H.pylori阳性慢性胃炎组胃黏膜中NFκB p65表达较H.pylori阴性组明显增强，且p65蛋白胞核着色较H.pylori阴性者明显增多，提示H.pylori感染诱导和激活胃黏膜NFκB，使其移位到核，发挥转录调节功能. 此外，胃黏膜NFκB的表达与慢性炎症和活动性的程度相关，表明NFκB的诱导激活与H.pylori相关性胃炎的发生发展密切相关. Isomoto等［7］和Gijs等［8］的研究结果亦支持此观点. 已知IL8是胃黏膜上皮细胞暴露于H.pylori后分泌的强有力的中性粒细胞和淋巴细胞趋化激活因子，在H.pylori免疫致病机制中起重要作用. 我们的研究表明，H.pylori感染使胃黏膜中IL8 mRNA和蛋白的表达明显增强，并与胃炎的活动度、炎症程度及H.pylori密度均显著相关.  IL8基因序列上含有NFκB的结合位点，细胞中NFκB的激活可导致IL8基因转录增加 ［2］.  本研究显示，在H.pylori阳性胃炎黏膜中NFκB表达水平与IL8 mRNA和蛋白的表达均呈正相关关系，因此我们推测NFκB可能通过调控炎性细胞因子IL8基因转录，参与了H.pylori的致病过程,且在其中占据重要地位. 总之，NFκB在H.pylori相关性胃炎发病中的作用正日益受到关注，为我们提供了一个抗H.pylori所致炎症的设计思路，即通过抑制NFκB的活性以抑制炎症的强度. 目前体外实验已证实［9,10］，NFκB抑制剂(如PDTC,p65和p50的反义寡脱氧核苷酸)在阻断H.pylori诱导的NFκB活化的同时，也使胃上皮细胞分泌的炎性细胞因子减少. 因此我们有理由相信，通过干预NFκB活性来改善H.pylori相关性胃炎治疗的效果是一个可行的方法.

 

作者：曹萍，卢启明，张岫兰   第四军医大学学报 2005 年 8 月 第 25 卷 第 15 期

 

　　【参考文献】

　　［1］ Aggarwal BB, Takada Y, Shishodia S, et al. Nuclear transcription factor NFkappaB: Role in biology and medicine［J］. Indian J Exp Biol, 2004;42(4):341-353.

　　［2］ Tak PP, Firestein GS. NFkappaB: A key role in inflammatory disease［J］. J Clin Invest, 2001;107(1):7-11.

　　［3］ 张宁，徐永健，张珍祥. 核因子κB对人单核细胞诱导型一氧化氮合酶表达的调控作用［J］. 第四军医大学学报，2004；25（12）：1077-1080.

　　Zhang N，Xu YJ，Zhang ZX.  Nuclear factor κB regulates gene expression of inducible nitrocoxide synthase in human monocyte［J］. J Fourth Mil Med Univ，2004；25（12）：1077-1080.

　　［4］ 陈保龙，袁先厚，江普查，等. 星形细胞肿瘤组织中核因子κB的表达与肿瘤增殖［J］. 第四军医大学学报，2003；24（7）：651-653.

　　Chen BL，Yuan XH，Jiang PC，et al.  NFκB expression in the astrocytic tumors and its relation to tumor proliferation［J］. J Fourth Mil Med Univ，2003；24（7）：651-653.

　　［5］ Sieveking D, Mitchell HM, Day AS. Gastric epithelial cell CXC chemokine secretion following Helicobacter pylori infection in vitro［J］. J Gastroenterol Hepatol, 2004;19(9):982-987.

　　［6］ Shimizu T, Haruna H, Ohtsuka Y, et al. Cytokines in the gastric mucosa of children with Helicobacter pylori infection［J］. Acta Paediatr, 2004;93(3):322-326.

　　［7］ Isomoto H, Mizuta Y, Miyazaki M, et al. Implication of NFkappaB in Helicobacter pyloriassociated gastritis［J］. Am J Gastroenterol, 2000;95(10):2768-2776.

　　［8］ Gijs R, Fiedo J, Cyriel Y, et al. Expression and activation of NFκB in the antrum of the human stomach［J］. J Immunol, 2000;164(6):3353-3359.

　　［9］ 史彤，刘文忠，高飞，等.  幽门螺杆菌刺激胃癌细胞株SGC7901分泌白细胞介素8过程中核因子κB的作用［J］. 中华医学杂志，2003；83（2）：133-136.

　　Shi T，Liu WZ，Gao F，et al. The role of nuclear factor kappa B in secretion of interleukin8 by gastric cancer cell line SGC 7901 induced by Helicobacter pylori［J］. Natl Med J China，2003；83（2）：133-136.

　　［10］ Kim H, Lim JW, Kim KH. Helicobacter pyloriinduced expression of interleukin8 and cyclooxygenase2 in AGS gastric epithelial cells: Mediation by nuclear factorkappaB［J］. Scand J Gastroenterol, 2001;36(7):706-722.