微生物检验比对考核的检验思路探讨

【摘要】 目的  探讨微生物检验比对考核的检验思路。 方法  以2005年广东省疾病预防控制中心组织的微生物实验室间比对试验为例，对3号项目考核样品使用现行有效的微生物检验技术规范和相关传染病诊断标准进行鉴定。 结果  根据组织单位提供的已知提示，并充分利用自己的已知知识，尽量缩小范围，检出3号项目考核样品是宋内志贺菌Ⅰ相和福氏志贺菌2a型的混合菌株。 结论  参加微生物检验比对考核时要充分利用已知知识进行检验，并要留意样品是纯菌株还是混合菌株。      

 

 

　　【关键词】  比对考核;宋内志贺菌Ⅰ相;福氏志贺菌2a型;混合菌株;纯菌株

 

 

　　在微生物检验中，无论是日常工作或是比对考核，如果不知菌株来源，即不知菌株采集于人体何部位，采集于何种食物、使用物品或环境时，对未知菌株的分离鉴定，目前没有固定的检验程序［1～4］ ，只有在确定了菌株的来源或针对性要检验某个可疑菌属，才有相关来源菌的检验流程［1］ 或相关菌属的检验程序 ［2］ 。微生物检验比对考核一般说明菌株来源或指明了某一方向，对未知菌株进行鉴定时可以根据这些提示来缩小检验范围。下面以2005年广东省疾病预防控制中心组织的微生物实验室间比对试验为例，探讨微生物检验比对考核的检验思路。对3号项目考核样品进行检验，检验思路和检验结果如下。

 

　　1 对象、试剂、仪器和方法    

 

　　1.1 对象 广东省疾病预防控制中心提供的比对考核3号项目考核样品。   

 

　　1.2 试剂 各种微生物检验用染色液试剂、增菌培养基试剂、分离培养基试剂、生化试验试剂和鉴定血清试剂。

 

　　1.3 仪器 生化培养箱、冰箱、显微镜。   

 

　　1.4 方法 《全国临床检验操作规程》（第2版）-1997;《食品卫生微生物学检验》GB/T4789.1～31-2003;《传染病诊断标准及相关法规汇编》-2003。

 

　　2 检测思路和检测结果    

 

　　2.1 样品来源及样品性状广东省疾病预防控制中心提供的微生物实验室间比对项目的3号项目样品，是从1例急性肠道传染病病人粪便中分离出的肠道致病菌培养物，属需氧或兼性厌氧菌。该样品为子弹管装冻干粉剂菌株，样品运送温度为常温。   

 

　　2.2 检测思路 从已知条件来看，从需氧状况看，该菌株属需氧或兼性厌氧菌可以排除厌氧菌;运送温度为常温，说明该菌株是中温菌，可以排除嗜冷菌、嗜热菌;该菌株来源于1例急性肠道传染病人的粪便，说明该菌株为肠道菌，而且是致病菌，可引起急性致病，可以排除肠道正常菌群和肠道条件致病菌。根据《全国临床检验操作规程》（第2版）-1997提供的粪便标本中常见的病原菌种类，不是厌氧菌的革兰阳性菌有:金黄色葡萄球菌、结核分枝杆菌、白色念珠菌;革兰阴性菌有伤寒及其它沙门菌、志贺菌、致病大肠埃希菌、弧菌属菌种、气单胞菌种、邻单胞菌、小肠结肠炎耶尔森菌、弯曲菌。鉴定时可以将范围缩至这11种菌，培养基可以选择这11种菌的增菌培养基和分离培养基。在选择增菌培养基和分离培养基时，要充分考虑各种类型的常用培养基和专用培养基。

 

　　2.3 培养、观察和鉴定   

 

　　2.3.1 复苏培养 由于该样品为子弹管装冻干粉剂菌株，无法直接涂片镜检，必须进行复苏培养。用接种环挑取冻干粉剂菌株分别接种于营养肉汤中，36℃分别培养6h;接种于加有血清的布氏肉汤中，43℃微需氧培养8h。   

 

　　2.3.2 接种 挑取—接种环于营养肉汤分别直接划线接种于一块普通琼脂平板和一块血琼脂平板中，36℃培养24h。同时接种普通琼脂平板和血琼脂平板，除可以观察菌落形态特征外，还可以互相对比观察该菌的营养要求、色素及溶血性等。   

 

　　2.3.3 增菌培养 吸取生长良好的营养肉汤培养物0.5ml接种于下列增菌液:碱胨水、SC增菌液、GN增菌液、肠道菌增菌肉汤、氯化钠结晶紫增菌液、7.5%氯化钠肉汤、改良PBS。其中GN增菌液36℃培养6h、碱胨水36℃培养8h，改良PBS4℃培养1天、3周，其它增菌液36℃培养24h。吸取加有血清的布氏肉汤培养物0.5ml接种于CEM增菌液，43℃微需氧培养48h。   

 

　　2.3.4 分离培养 将上述增菌液分别接种于下列平板培养。（1）碱胨水-四号琼脂平板和TCBS平板，36℃培养24h。（2）SC增菌液-SS平板和EMB平板，36℃培养24h。（3）GN增菌液-SS平板和EMB平板，36℃培养24h。（4）肠道菌增菌肉汤-SS平板、HE平板、麦康凯平板和EMB平板，36℃培养24h。（5）氯化钠结晶紫增菌液-TCBS平板，36℃培养24h。（6）7.5%氯化钠肉汤-血琼脂平板，36℃培养24h。（7）改良PBS-NYE平板和麦康凯平板，分别在22℃和36℃培养48h。（8）CEM增菌液-Camp-BAP血琼脂平板、Skirrow血琼脂平板，43℃微需氧培养48h。   

 

 

　　2.3.5 菌落形态观察 （1）普通琼脂平板36℃培养24h后平板上生长形成中等大小、无色透明、湿润、边缘整齐、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形态一致。（2）血琼脂平板36℃培养24h后平板上生长形成中等大小、白色、湿润、边缘整齐、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形态一致。（3）SS平板、麦康凯平板和EMB平板36℃培养24h后平板上分别生长形成中等大小、无色透明、湿润、边缘整齐、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形态一致。（4）HE平板36℃培养24h后平板上生长形成中等大小、绿色透明、湿润、边缘整齐、表面光滑、稍呈隆起的菌落，菌落形态一致。（5）SS平板、麦康凯平板和EMB平板在36℃培养48h后菌落发生变化:SS平板、EMB平板的菌落变粉红色;麦康凯平板上的菌落变灰白色，并形成粗糙形菌落。   

 

 

　　2.3.6 染色镜检 各挑取普通琼脂平板、血平板、SS平板、HE平板、麦康凯平板和EMB平板上单个菌落，染色镜检，发现革兰阴性的短小杆菌，菌体形态一致。   

 

 

　　2.3.7 纯培养及初步生化试验 挑取各平板上的单个菌落接种于三糖铁琼脂和葡萄糖半固体，36℃培养24h。每个平板挑取5个菌落分别接种5支三糖铁琼脂、挑取5个菌落分别接种五支葡萄糖半固体，防止漏检。观察可见所有三糖铁琼脂培养物均发酵葡萄糖、产酸不产气，不发酵乳糖、蔗糖;所有葡萄糖半固体培养物发酵葡萄糖、产酸不产气、沿穿刺线生长、无动力。   

 

　　2.3.8 氧化酶试验 挑取各平板培养物、三糖铁培养基培养物做氧化酶试验:均为阴性。   

 

　　2.3.9 血清学分型 根据该菌的培养特性、营养要求、菌落形态和菌体形态特征及初步生化试验、氧化酶试验结果，挑取三糖铁琼脂上的培养物，做下列玻片凝集试验，观察结果。   

 

　　志贺菌4种多价诊断血清:凝集;宋内志贺菌血清:凝集;宋内志贺菌Ⅰ相血清:凝集。其中有1支从GN增菌液分离到SS平板再接种到三糖铁琼脂上的三糖铁琼脂培养物，志贺菌4种多价诊断血清不凝集;将菌液煮沸后再做玻片凝集试验，仍然不凝集;用鲍氏多价1、2、3分别检查，也不凝集;用痢疾志贺菌3～12型多价血清检查，也不凝集;将此三糖铁琼脂培养物进行传代培养后，再做玻片凝集试验。志贺菌4种多价诊断血清:凝集;福氏志贺菌多价血清:凝集;福氏志贺菌2型血清:凝集;福氏志贺菌群3，4因子血清:凝集;   

 

　　2.3.10 进一步生化反应 志贺菌属血清凝集的细菌，还需用生化试验进一步确认，防止诊断血清出现假阳性反应。

 

　　2.3.10.1 挑取三糖铁培养基培养物进行下列生化试验，观察结果。    

　　表1 宋内志贺菌Ⅰ相血清凝集的三糖铁琼脂培养物生化试验（略）

　　注:“+”为阳性;“-”为阴性    

　　表2 福氏志贺菌2型血清、群3，4因子血清凝集的三糖铁琼脂培养物生化试验（略）

　　注:“+”为阳性;“-”为阴性    

　　2.3.10.2 挑取三糖铁培养基培养物进行下列生化分群试验，观察结果。    

　　表3 宋内志贺菌Ⅰ相血清凝集的三糖铁琼脂培养物生化试验（略）

　　注:“+”为阳性;“-”为阴性    

　　表4 福氏志贺菌2型血清、群3，4因子血清凝集的三糖铁琼脂培养物生化试验（（略）

　　注:“+”为阳性;“-”为阴性    

　　2.3.11 鉴定结果 检出宋内志贺菌Ⅰ相和福氏志贺菌2a型。    

　　3 讨论    

 

　　3.1 对未知菌株的鉴定，一般可以采用下列顺序直接涂片镜检、增菌培养、分离培养、菌落和菌体观察、纯培养、生化反应试验和血清学鉴定、药物敏感性试验和动物实验。药物敏感性实验和动物实验按菌株鉴定要求做。本例比对考核由于该样品为冻干粉剂菌株，无法直接涂片镜检，必须先进行复苏培养、增菌培养、接种平板后才能镜检。    

 

　　3.2 鉴定菌株的首要条件是将菌株进行纯培养对分离培养物进行菌落观察和镜检观察菌体形态，只有菌落形态和菌体形态都一致时，才能进行纯培养和鉴定，否则还须继续分纯。挑取菌落形态和菌体形态都一致的可疑菌落进行纯培养，然后再对纯菌株进行一系列的鉴定。进行纯培养时，当需要细菌数量较多时，应用分离平板进行纯培养;若只需少量细菌，可用三糖铁琼脂进行纯培养，并可同时观察初步生化反应。由于某些菌属之间或同菌属不同菌型的细菌之间的菌落形态及菌体形态相似，进行纯培养时，应在同一平板上多挑几个单个菌落进行纯培养，防止不同菌属之间或同菌属不同菌型的细菌之间出现漏检。   

 

　　3.3 有条件的单位可以使用自动化鉴定系统［4］  既可以大大缩短检验时间又可以节省大量的工作量。自动化鉴定虽然还不是国家标准方法，但其结果可以作为未知菌株鉴定的参考。   

 

　　3.4 质量控制 整个检验过程注意无菌操作，使用空白对照，阴、阳性对照，可以保证试验的成功;染色液、培养基、试剂、诊断血清等要在有效期内使用，并且要用已知参考菌株进行测试;选用合适的鉴定系统，并将分离菌株与相关的参考菌进行比较，可以有效保证实际应用鉴定系统。

作者：李义强    中华医药杂志 2005年8月 第5卷 第8期

 

　　【参考文献】    

　　1 中华人民共和国卫生部医政司.微生物学检验，全国临床检验操作规程，第2版.1997，437-576.

　　2 中华人民共和国卫生部，中国国家标准化管理委员会.中华人民共和国国家标准，食品卫生微生物学检验，2003，1-249. 

　　3 卫生部卫生监督中心卫生标准处.传染病诊断标准及相关法规汇编，2003，53-305.    

　　4 东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册，北京:人民卫生出版社，2001，57.