伤寒杆菌O抗与H抗血清的制备及其应用

在微生物实验课教学中,肥大反应(widal stest)被列为本科临床专业学生实验的必修内容之一。近年来,由于抗生素的早期应用,临床随机采集的患者血清标本抗体含量很低,实验中很难出现典型的抗原抗体凝集现象,由于实验要用到抗血清,而抗血清又难以买到,价格也昂贵,为了节约经费，使用方便，我们尝试了自制抗血清，并且在实验教学中，通过制备抗血清进行抗原抗体之间免疫学反应，使学生获得有关抗原、抗体、抗原抗体间的免疫反应这些抽象的免疫学的基本知识，使教学获得了较好的效果。

 

　　1  材料与方法

 

　　1.1  动物的选择  实验动物为家兔，体重1.5 kg/只~2.0 kg/只。

 

　　1.2  抗原的制备伤寒杆菌的抗原制备  采用北京生物制品鉴定所提供的国内标准菌株伤寒杆菌“O”接种在普通琼脂平板上约20只～30只，置37 ℃培养18 h～24 h，取培养物作涂片，并行革兰染色，经显微镜观察应均为革兰阴性杆菌的纯培养物，并作生化鉴定，葡萄糖(+)、乳糖(-)、靛基质(-)、尿素(-)、动力(+)，并用伤寒诊断血清“O”作玻片凝集，出现颗粒凝集确诊为伤寒杆菌“O”抗原,如有污染杂菌的平板应弃去，而纯培养的平板加5 ml～6 ml无菌生理盐水，用L型玻棒刮下菌苔，离心沉淀（2 500转/min，10 min），同法用无菌生理盐水洗涤两次，弃上清，取沉淀物加适量灭菌生理盐水配成30亿/ml的菌液［1］，并按菌量加入0.3%～0.5%甲醛作防腐，置37 ℃作用30 min进行杀菌处理，即为伤寒杆菌“O”菌液，置4 ℃冰箱备用。伤寒杆菌“H”菌液的制备［1］，方法同伤寒杆菌“O” 抗原制备，此菌株也来自北京生物制品鉴定所。

 

　　1.3  免疫动物的方法［2］  实验动物为家兔，共12只，分别注射伤寒杆菌“O”、“H”菌液各6只，程序见表1。表1：免疫注射程序日期（略）    

 

　　2  结果与保存

　　

　　2.1  抗血清效价测定与保存  于末次免疫1周后在耳缘静脉采血2 ml分离血清，抗血清效价测定采用试管凝集法（肥大反应），用生理盐水作血清稀释液，倍比依次稀释血清，置37 ℃ 24 h后观察结果，以呈现++凝集的血清最高稀释倍数作为血清凝集的效价。达到理想的抗体效价后采用心脏采血收集血清分装成小瓶，每瓶约3 ml~5 ml，做好标记，置-20 ℃冰箱保存。

 

　　2.2  试管凝集实验  将10个洁净凝集试管，依次加0.5 ml生理盐水,取1∶400稀释的伤寒杆菌抗血清0.5 ml(血清稀释视抗血清效价而定,效价高稀释倍数就高，教科书上抗血清稀释倍数一般从1∶40开始)，加入1号管,混匀后,取0.5 ml加入2号管,混匀,取0.5 ml加入3号管,依次稀释,8号管混匀后吸0.5 ml弃去,10号管为对照管,从10号管开始,从后向前依次加入0.5 ml伤寒杆菌均“O”“H”菌悬液（7亿/ml）［1］，各管混匀，置37 ℃静置24 h，使抗原抗体充分反应，判断效价见表2，以呈现50%凝集，出现“++”（上清液稍浑浊，凝集物明显）的最高血清稀释倍数为血清的效价。表2：伤寒杆菌“O”、“H”抗血清凝集效价测定（略）菌液+0.85%盐水-免疫6只家兔伤寒杆菌抗血清的平均几何效价，伤寒“O”抗血清为1∶16 060，“H”抗血清为1∶25 600（见表3）。将“O”“H”抗血清按一定比例混合后，血清适当稀释代替伤寒病人血清，可得到理想的实验结果。表3：伤寒杆菌“O”、“H”抗血清几何平均滴度免疫途径（略）实验注意事项：细菌的培养要无菌操作，不能混入杂菌。所选用的兔子要预先用伤寒杆菌“O”、“H”菌液做抗体检测，不能选用已有抗伤寒杆菌“O”、“H”抗体的兔子。在免疫兔子时注意注射器的灭菌消毒，针头是否堵塞。注射耳缘静脉时，先用酒精将耳缘静脉来回擦，使它充血增粗，易于注射。在两次耳缘静脉注射后，兔子可能会出现身体不适，有拉稀或耳朵腐烂等症状，可减少注射量和次数，等好些再注射。收集血清时，将血液置于干燥的培养皿中，放4 ℃冰箱过夜，次日用滴管吸取，避免震动，以免溶血影响血清质量。

 

　3讨论

 

　　经过几届学生的实验，作者认为自制的抗血清实验效果好，使用方便，随用随取。这样避免了因实验材料的购买困难而影响实验课的开设，能保质保量地完成实验教学任务。经济效益较高，购买的抗血清价格昂贵且效价不高，而自制的抗血清不需要耗费太多的材料，可为学校节约实验经费。自制的伤寒杆菌抗血清还可用于血清学的凝集反应，即用已知的伤寒杆菌抗血清与伤寒杆菌菌悬液10亿/ml结合，形成抗原抗体复合物，使学生对抗原、抗体抽象的概念得以了解，也可以观察感觉到它的客观实在，是一个建立免疫学概念的好实验。

作者：蔡玲斐   《实用医技杂志》(杭州师范学院，浙江杭州 310018)

 

　　参考文献：

 

　　［1］  扬履渭.微生物学及检验技术（沙门氏菌属）［M］.广州：广东科技出版社，1992，4：155.

　　［2］  蔡玲斐.不同免疫途径制备伤寒抗血清效价的比较［J］.杭州医学高等专科学校学报，2002，23(3)：106.