酵母样真菌对抗真菌药物耐药性研究进展

摘  要

　　自上世纪八十年代以来，在影响人类健康的感染性疾病中，真菌感染在免疫受损的病人群体中发病率有较大幅度提高，其原因可能与HIV感染、癌症患者放疗和/或化疗、器官和骨髓移植、广谱抗生素的滥用、激素的应用以及静脉插管和血液透析等介入性操作的增加等因素有关[1－4]。

　　关键词：酵母样真菌；抗真菌药物；耐药性

 Advance in study of resistance of yeast－like fungi to antifungal drugs

 

　　Key Words：yeasts，yeast－like fungi，antifungal drugs，resistance

 

　　自上世纪八十年代以来，在影响人类健康的感染性疾病中，真菌感染在免疫受损的病人群体中发病率有较大幅度提高，其原因可能与HIV感染、癌症患者放疗和/或化疗、器官和骨髓移植、广谱抗生素的滥用、激素的应用以及静脉插管和血液透析等介入性操作的增加等因素有关[1～4]。在临床上，真菌感染率的上升，提高了对抗真菌药物的使用率，随之而来耐药菌株也不断增多，给临床的治疗带来一定的困难[5，6]。本文简要综述酵母样真菌对抗真菌药物耐药性方面研究进展。

 

　　1酵母样真菌感染流行情况

　　在过去20年里，酵母样真菌引起的全身性感染呈上升趋势。在美国医院获得性血流感染中，念珠菌排在第四位。据国外报道每年念珠菌引起的人群发病率为2/10万～10/10万，念珠菌引起血流感染的死亡率1983～1986年间为38％，1997～2001年间为49％。80％以上HIV阳性的患者在整个疾病过程中的某个阶段会出现口腔念珠菌病。尽管念珠菌引起的血流感染中白色念珠菌仍排在第1位，但所占比率有所下降，而非白色念珠菌的感染率有明显上升，尤其是光滑念珠菌和近平滑念珠菌。不同国家和地区念珠菌菌种分布和流行情况不尽相同。

　　1993年Beck Sague和Jarvis[7]报道美国国家院内感染调查系统院内真菌感染调查结果，真菌感染率从1980年的6％上升至1990年的10.4％，其中念珠菌感染约占80％。Pfaller等[8]报道美国、加拿大和南美洲等34个医学中心1997年1月至12月由念珠菌引起的血流感染国际监测结果，306例念珠菌血症中，白色念珠菌占53.3％，近平滑念珠菌、光滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌、季也蒙念珠菌及其他念珠菌分别占15.7％、15.0％、7.8％、2.0％、0.7％和5.5％。Hajjeh RA等[9]报道1998～2000年间从康涅狄格和巴尔的摩收集了1443株引起血流感染的念珠菌，其中白色念珠菌占45％，光滑念珠菌、近平滑念珠菌、热带念珠菌、克柔念珠菌等分别占24％、13％、12％和2％，其他念珠菌只占4％。Phillips JR等报道1989年1月至1995年6月在美国某医院新生儿监护病房获得性尿道感染中，念珠菌分离率为42％（25/60）。

　　Meis J等[10]报道1997年6月至1998年12月间全球抗真菌监测研究组从临床收集了20900个酵母样真菌，监测数据表明真菌血症病原菌中第1位为白色念珠菌（69％），第2位为光滑念珠菌（10％），其它念珠菌只占21％，只有少数几个国家近平滑念珠菌的比例超过光滑念珠菌，详细结果见表1。

　　在法国里昂Martin D等[11]回顾分析了5个细菌学实验室1998～2001年血培养中念珠菌分离情况，在这段时间共从190个病人（共中内科占32％、血液科占23％、外科占23％、重症监护病房占22％）中分离出198株念珠菌，有8个病人分离出2株不同菌株。白色念珠菌分离率排第1位，占49.5％，其次为光滑念珠菌和近平滑念珠菌，分别占12.6％、12.1％，克柔念珠菌、热带念珠菌和其他念珠菌分别占10.6％、10.1％和5％。内科、外科和重症监护病房病人血流感染白色念珠菌分离率均排第1位，分别占54.8（40/73）、57.6％（19/33）、68.6％（22/32），而血液科克柔念珠菌分离率排第1位，占34.0％（16/47）。

　　在阿根廷Mujica MT等报道1999－2001年从临床标本中分离了1006株酵母样真菌，白色念珠菌占40.3％，非白色念珠菌占54.9％。酵母样真菌引起的血流感染中近平滑念珠菌占34.9％、白色念珠菌和热带念珠菌分别占30.2％和25.6％，光滑念珠菌仅占2.3％。白色念珠菌占皮肤粘膜感染分离菌的60％～80％。酵母样真菌引起的尿道感染中白色念珠菌占47.7％，光滑念珠菌和热带念珠菌分别占24.8％和20.0％。念珠菌引起的甲癣中，近平滑念珠菌（37.7％）取代白色念珠菌（22.0％）排在第1位。

　　关于非白色念珠菌引起的真菌血症，Kremery V等进行了研究和报道[12]，1991～1998年间在普通病人中35％～65％念珠菌血症是由非白色念珠菌引起。在肿瘤患者，主要是恶性血液病和骨髓移植病人感染率最高，达40％～70％；但在监护病房和外科病人（35％～55％）、儿童（1％～35％）或HIV阳性患者（0％～33％）感染率相对较低。最常见非白色念珠菌是近平滑念珠菌（20％～40％）、热带念珠菌（10％～30％）、克柔念珠菌（10％～35％）和光滑念珠菌（5％～40％），葡萄芽念珠菌和季也蒙念珠菌感染率分别为2％～8％和1％～5％，其他非白色念珠菌如：皱折念珠菌、乳酒念珠菌、类星念珠菌、挪威念珠菌和无名念珠菌真菌血症的感染率低于1％。非白色念珠菌感染引起的死亡率为15％～35％，其中光滑念珠菌感染引起的死亡率最高达40％～70％。

　　在我国，深部真菌感染的发生率也呈逐渐增高的趋势。吴绍熙等报道[13]1986年1月1日～12月31日和1996年1月1日～12月31日在全国25个省、市、自治区40多个有代表性的单位对临床或现场确定的致病真菌进行了动态研究，就病原菌变迁、各地区动态情况和具体疾病等作了较详细分析。发现在1986年占第5位的白色念珠菌到1996年已升至第2位，所占比率亦从1986年的5％上升至19.6％，其他非白色念珠菌所占比率均不同程度上升。余进等学者[14]对北京医科大学第一医院从1998年6月至1999年12月住院和急诊留观病人不同部位念珠菌培养阳性的临床标本进行致病菌种调查。595份念珠菌培养阳性的临床标本，其中白色念珠菌为主要的病原菌，占72.6％（432/595），非白色念珠菌占27.1％（163/595）。非白色念珠菌排前3位的是热带念珠菌、光滑念珠菌和近平滑念珠菌，分别占12.1％、5.7％和5.7％。不同部位的念珠菌感染情况：痰培养阳性有477份，其中白色念珠菌占78.6％，以下依次为热带念珠菌、光滑念珠菌、近平滑念珠菌和克柔念珠菌，分别占11.1％、4.4％、3.1％和2.1％。血培养阳性只有8份，其中白色念珠菌2株、近平滑念珠菌3株、热带念珠菌1株、光滑念珠菌1株和未分类念珠菌1株；尿培养阳性有71份，白色念珠菌占39.4％，其次为热带念珠菌和近平滑念珠菌，各占21.1％，光滑念珠菌占12.7％，克柔念珠菌占2.8％。

　　引起系统性念珠菌感染的危险因素包括年龄、氮质血症、中央静脉插管、化疗、定植、粘膜屏障损伤、器官移植、血液透析、糖尿病、长期使用广谱抗生素、嗜中性白细胞减少症、肠外营养、使用类固醇激素及外科手术等。SENTRY和EIEIO监测发现随着病人年龄增长，白色念珠菌引起的真菌血症减少，而光滑念珠菌引起的真菌血症增加。老年人光滑念珠菌和克柔念珠菌比例相应增加。

　　2抗真菌药物作用机制

　　抗真菌药物按结构类型大致可分为抗生素类、嘧啶类、烯丙胺类、吗啉类、苯胺类、硫代氨基甲酸酯类、唑类（包括咪唑和三唑）等。按其作用机制大致可分为干扰真菌细胞质膜，影响细胞DNA或RNA合成、影响真菌细胞壁合成和抑制真菌蛋白质合成等几种类型。下面简要介绍抗真菌药物作用机制。

　　2.1干扰真菌细胞质膜

麦角甾醇是真菌细胞质膜的重要成分，它是一种准平面分子，通过与磷脂结合稳定磷脂相，从而增加膜的稳定性。麦角甾醇缺乏以及非平面甾醇前体累积会导致真菌膜的破裂。多烯类和唑类的抗真菌作用都与损害真菌质膜有关。

　　2.11直接和麦角甾醇结合，影响膜的稳定性

　　多烯类抗真菌药物包括两性霉素及其衍生物、制霉菌素等。这类药物分子具有亲水和疏水两种特性。其作用机制是药物进入细胞质膜直接与麦角甾醇结合，损伤细胞膜，使其形成通道，致使细胞内的重要成分，尤其是钾离子等外漏，破坏了细胞的正常代谢而抑制其生长[15]。

　　2.12影响麦角甾醇合成

　　麦角甾醇的合成是个复杂的过程，以乙酰辅酶A起始合成麦角甾醇，经过近20步酶促反应。生物合成麦角甾醇中，抗真菌药物主要从四个环节影响或作用于麦角甾醇的生物合成，即抑制角鲨烯环氧化酶，抑制C14－去甲基化酶，抑制△14－还原酶和△8→△7异构化酶，抑制C24－甲基转移酶。

　　2.121抑制角鲨烯转化为2，3－环氧角鲨烯所需的角鲨烯环氧化酶

　　角鲨烯环氧化酶与质膜相结合，需分子O2、NAD（P）H和FAD，它不属于P－450酶系，在角鲨烯转化为刚性甾体环的过程中起着重要作用。烯丙胺类、苯胺类、硫代氨基甲酸酯类都能抑制这一步反应，引起角鲨烯在质膜上累积，造成膜的损坏，其代表化合物有萘替芬、特比萘芬、布替萘芬和托萘酯。

　　2.122抑制C14－去甲基化酶

　　麦角甾醇生物合成途径中，关键酶之一催化羊毛甾醇脱去甾醇环上14位碳原子的14α－去甲基化酶（简称P45014DM）。该酶是所有唑类药物共同作用的靶酶。按化学结构可将唑类药物分为2类，即分子中含有咪唑环（五员环中含有2个氮原子）的咪唑类和含有三咪环（五员环中含有3个氮原子）的三唑类。咪康唑和酮康唑属咪唑类；氟康唑和伊曲康唑属于三唑类。这些唑类药物作用于P45014DM，阻断去甲基反应，抑制麦角甾醇的生物合成造成膜麦角甾醇缺乏，14α－甲基甾醇等在膜内蓄积，使细胞膜的结构和功能发生改变，进而使膜的通透性增加和结合在膜上的醇活性异常，使真菌的发育受到抑制，直至死亡。

　　2.2影响真菌细胞壁合成[16]

　　细胞壁代谢与真菌的生长和分裂密切相关，其作用是控制细胞内膨胀压力以保持菌体的完整性，其细胞壁的破坏必然导致菌体溶解。大多数真菌细胞壁成分包括几丁质、β－（1，3）－葡聚糖和各种甘露糖蛋白。按作用机制不同，作用于细胞壁的抗真菌药物可分为β－（1，3）－葡聚糖合成酶抑制剂、几丁质合成酶抑制剂、甘露聚糖－蛋白质复合物抑制剂。

　　2.21作用于β－（1，3）－葡聚糖合成酶

　　β－（1，3）－葡聚糖合成酶位于细胞膜，它催化转运尿苷二磷酸中的葡萄糖基生成β－（1，3）－葡聚糖。β－（1，3）－葡聚糖合成酶为真菌生长所必需，抑制该酶可使细胞壁结构异常，导致细胞破裂，细胞内容物渗漏。棘球白素B类似物和阜孢霉素类似物是两大类β－（1，3）－葡聚糖合成酶非竞争性抑制剂。

　　2.22作用于几丁质合成酶

　　几丁质是β－（1，4）连接的N－乙酰葡萄糖胺的链状聚合物，是细胞壁的支架结构。几丁质合成酶催化N－乙酰葡萄糖胺的聚合，在真菌的细胞分裂和成熟中起了重要作用。真菌体内有3种几丁质合成酶：Chs1、Chs2和Chs3。其中Chs1是修复酶，不是必需的，而Chs2和Chs3非常重要。多氧菌素D和尼可霉素Z和X是两类几丁质合成酶抑制剂，其中以尼可霉素Z和X研究得较为深入。尼可霉素Z和X的结构与几丁质合成酶的底物UDP－N－乙酰葡糖胺类似，因而可竞争性地抑制几丁质合成酶。但这类药物的抗菌谱相对较窄。经研究证实，尼可霉素与氮唑类药物（氟康唑、伊曲康唑）联合应用会大大提高疗效。目前又筛选出一个新型的几丁质合成酶抑制剂arthrichitin。此抑制剂克服了尼可霉素抗菌谱窄的缺点，对念珠菌、隐球菌等具有广谱活性。

　　2.23作用于甘露聚糖和甘露聚糖－蛋白质复合物

　　甘露聚糖和甘露聚糖－蛋白质复合物是真菌细胞壁的中、外层结构。普那米星和benamomicin类药物通过Ca2+选择性地与真菌细胞壁上的甘露聚糖和甘露聚糖－蛋白质复合物桥连，使甘露聚糖的空间结构发生改变，从而引起细胞壁破裂，细胞膜通透性增加，导致细胞死亡。

　　2.3抑制真菌蛋白质合成

　　2.31抑制真菌延长因子

　　延长因子（elongation factor，EF）是真菌和哺乳动物细胞中蛋白质的生物合成所必需的。延长因子有3种，EF1和EF2为真菌和哺乳动物所共有，EF3为真菌特有，并且真菌和哺乳动物细胞中的EF1和EF2结构差异很大。因此，EF是抗真菌药物设计中的重要靶点。粪壳菌素（sordarin）及其衍生物是选择性的EF2抑制剂，它作用于蛋白质的翻译过程。对EF3抑制剂的研究相对较少，目前还没有发现选择性作用于EF3的化合物。由于EF3为真菌所特有，这提示选择性EF3抑制剂可能是一类很有潜力的广谱抗真菌药物。

　　2.32抑制N－肉豆蔻酰基转移酶

　　在白色念珠菌、新型隐球菌和其他一些真菌中，N－肉豆蔻酰基转移酶催化将N－肉豆蔻酰基从CoA转移至蛋白质氨基酸末端的反应是必需的。因此，N－肉豆蔻酰基转移酶抑制剂可抑制某些真菌蛋白质的生物合成。

　　2.4影响DNA、RNA合成

　　5－氟胞嘧啶（5－FC）是目前临床比较常用的作用于核酸合成的抗真菌药物。其在渗透酶的帮助下进入真菌细胞，一旦进入胞内，则通过胞嘧啶脱氨酶转化成为5－氟尿嘧啶（5－FU）。随之，通过鸟苷酸（UMP）－焦磷酸酶转化为5－氟鸟苷酸（FUMP），其进一步被磷酸化后掺入到RNA中，最终破坏蛋白质的合成。5－FU也能够被转化为5－氟脱氧鸟嘧啶单磷酸，其能够抑制参与DNA合成和细胞核分裂的腺苷酸合成酶。因此，5－FC的抗菌作用机制涉及到干扰嘧啶的代谢、RNA和DNA的合成以及蛋白质的合成等。

　　灰黄霉素也是早期的抗真菌药物，因其结构与鸟嘌呤类似，竞争性抑制鸟嘌呤进入DNA分子，影响DNA合成。该化合物也可抑制哺乳动物细胞DNA合成，故毒性大，现已不常用。

　　3．酵母样真菌对抗真菌药物耐药机制

　　近十年来针对真菌耐药机制开展了多项研究，其中研究较多且较清楚的是酵母样真菌尤其是念珠菌对唑类药物的耐药机制。真菌耐药与细菌有相似之处，可分为固有（或内在）耐药和获得性耐药，常见对唑类药物固有耐药的念珠菌有克柔念珠菌和光滑念珠菌。约10％临床分离的白色念珠菌对5－FC存在固有耐药，30％菌株暴露于5－FC后可发展为获得性耐药。葡萄芽念珠菌对两性霉素B也存在固有耐药。酵母样真菌耐药机制主要有：（1）药物的靶酶产生增多或靶酶结构改变使得药物对其亲和力减低；（2） 真菌细胞内药物累积减少；（3）代谢途径改变；（4）生物被膜形成。对某一耐药菌株而言，各种机制既可以单独起作用，又可以两种或多种机制同时作用。通常来讲，参与耐药的机制越多，耐药程度越重。以下简述酵母样真菌耐药机制的研究现状。

　　3.1对唑类药物的耐药机制

　　唑类抗真菌药物是目前临床上主要的治疗真菌感染药物，现在临床上使用的该类药物包括：咪唑类药物酮康唑、克霉唑、益康唑、咪康唑和联苯苄唑等；三唑类药物氟康唑、伊曲康唑和特康唑等。迄今为止，多数学者认为念珠菌对唑类药物的耐药机制主要涉及以下几个方面。

　　3.11药物作用靶位改变14α－z去甲基化酶（P45014DM）是唑类药物的靶向酶。P45014DM结构改变与过度表达均可导致念珠菌对此类药物耐药。与药物作用靶位改变相关的耐药机制主要有以下几个方面。

　　3.111靶酶基因突变

　　靶酶基因Erg11（以前称为CYP51）编码区发生改变，可引起酶三维结构和活性发生改变，导致酶与药物的亲和力减低而产生耐药。Asai等[17]研究发现白色念珠菌的P45014DM对唑类药物敏感性下降，但酶本身的催化活力并无显著改变。测序分析比较发现，耐药株靶酶基因Erg11编码区出现12个碱基的点突变，导致基因产物4个氨基酸改变。其中7个碱基突变可能与耐药株靶酶与底物的亲和力下降有关。每个耐药株靶酶基因Erg11编码区突变点位置和数量不完全相同。

　　3.112靶酶基因过度表达

　　靶酶基因调控区和/或相应的调节基因发生改变，靶酶基因过度表达，细胞内药物不能完全抑制靶酶的活性而耐药。Marichal等[18]发现光滑念珠菌对唑类药物耐药株Erg11基因拷贝数比敏感株多3.7倍，Erg11 mRNA水平比敏感株高8倍。光滑念珠菌Erg11基因过度表达，可由体内、外药物诱导所致。

　　3.12真菌细胞内药物累积减少

　　真菌细胞内药物累积减少是真菌产生耐药性的一个重要机制。一方面是因为膜通透性降低使进入的药物减少；另一方面细胞内的药物外排增强，近来研究表明，药物外排增强为其主要原因。

　　3.121细胞膜通透性降低

　　Ryley等最早报告由于细胞膜通透性降低，而使进入细胞内药物减少引起唑类药物耐药。耐药菌株对唑类药物的透过性发生改变，系因细胞膜上磷脂及甾醇组成均发生变化，从而影响到细胞膜的流动性，继而影响到通透性。Hazel等学者在对酿酒酵母菌的多药耐药基因筛选研究中发现PDR（pleiotropic drug resistance）16和PDR17基因与细胞通透性相关。PDR16和PDR17基因主要调控细胞内脂质合成和脂质转运，改变细胞膜上脂质组成，继而影响细胞膜的通透性，阻碍药物进入细胞体内。PDR16基因缺损，极大地改变了细胞膜上甾醇的组成，使酿酒酵母菌对咪康唑和酮康唑的敏感性提高了10～20倍；PDR17基因缺损改变了细胞膜上磷脂的组成和比例，但不影响咪康唑和酮康唑的敏感性；PDR16和PDR17基因同时缺损，可以使咪康唑和酮康唑的敏感性提高50～100倍。

　　3.122药物外排

　　真菌细胞对药物外排致耐药，是通过细胞膜上依赖能量的药物外排泵的主动转运，使细胞内药物浓度降低所致。该药物外排泵为多药耐药（multi－drug resistance， MDR）相关蛋白质。MDR蛋白有多种，根据其功能不同，可将其分为两大类。

　　3.1221ATP结合转运蛋白（ATP binding cassette transporters， ABCT）

　　ABCT是ATP能量依赖型多药转运载体，是细胞膜上的外排机能泵。研究表明，与白色念珠菌的MDR有关的ABCT转运载体编码基因CDR（Candida drug resistance）家族中，除CDR1以外，至少还存在9个以上，其中5个（CDR1，CDR2、CDR3、CDR4、CDR5）与唑类药物耐药性有关。目前认为CDR针对的主要是脂溶性分子。CDR1为白色念珠菌中最先发现的外排泵基因，大多数氟康唑耐药的白色念珠菌株中，都发现CDR1超表达，对咪唑药物都呈耐药性。CDR1缺损或突变株对咪唑类药物以及特比萘芬、阿莫罗芬等其他抗真菌药物和抗代谢药物高度敏感。CDR1基因表达产物为Cdr1p，具有ABCT载体蛋白的共性，是一种膜蛋白。整个蛋白有4个区，其中2个区为疏水区，为穿膜部分，另2个区推测为与ATP结合区。

　　Sanglard等研究发现CDR2超表达株显示对唑类药物特比萘芬和阿莫罗芬耐药。但CDR2单独破坏株并未显示对唑类药物高度敏感，而CDR1和CDR2同时破坏株显示对唑类药物高度敏感。临床分离的耐药株中，发现CDR1和CDR2都超表达。推测存在有这2个基因的共同激活因子。

　　3.1222易化扩散载体超家族（major facilitator superfamily， MFS）

　　这是一种通过电化学势能进行被动转运的MDR蛋白，属于非能量依赖型载体。在这个家族中由MDR1编码的Mdr1p是近年来研究的热点之一，目前认为MDR主要针对水溶性分子。Wirsching等[19]对一临床分离的MDR1基因过度表达的氟康唑耐药株进行研究，通过MDR1基因敲除发现，MDR1基因过度表达与氟康唑耐药有关，但与酮康唑无关，Mdr1p底物具有一定的特异性。Mdr1p可掺在细胞膜上占领特定的位点，发挥抑制药物摄入的作用。由于MDR1的表达受限，并且Mdr1p也只能占领细胞膜上的特定位点，因此，Mdr1p对药物摄入的抑制作用有一定限度，在耐药菌株中，仍有部分药物被摄入细胞内。

　　Cdr1p、Cdr2p与Mdr1p等均属MDR蛋白，近年来对真菌耐药性的研究多集中在这些蛋白上。Cdr1p、Cdr2p通过增加药物的外排，而Mdr1p通过抑制药物摄入降低细胞内药物浓度。

　　3.13代谢途径的改变

　　唑类药物通过抑制14α－去甲基化酶的活性，羊毛甾醇不能转换为14去甲基羊毛甾醇，从而阻断麦角甾醇的合成。羊毛甾醇在14还原酶的催化下生成14α－甲基类固醇，后者在由ERG3基因编码的△5，6去饱和酶催化下生成14α－甲基3，6－二醇。缺乏麦角甾醇和14α－甲基3，6－二醇的堆积抑制了真菌的生长。部分真菌由于ERG3基因的突变，不能产生有活性的△5，6去饱和酶，致使在细胞内累积的是14α－甲基类固醇而不是14α－甲基3，6－二醇，而14α－甲基类固醇能部分替代麦角甾醇的功能，维持真菌细胞生长，从而对唑类耐药。

　　3.14生物被膜形成

　　生物被膜是指微生物分泌于细胞外的多糖蛋白复合物，将自身包裹其中于生物表面形成的膜状物。膜内菌细胞的形态常与浮游菌不同，且对药物的敏感性差[20]。研究表明，许多念珠菌感染与念珠菌在内置医疗材料如静脉导管、尿道插管及人工合成瓣膜上所形成的生物被膜有关，且这些膜内真菌常表现出高度的耐药性。其耐药机制可能与下列因素有关：（1）膜内真菌生长速率慢；（2）胞外聚合物基质所形成的膜屏障作用；（3）表面诱导性耐药基因的表达。

　　3.2对两性霉素B耐药机制[21，22]

　　两性霉素B（Amphotericin B，AmB）属于多烯类抗真菌药物，其分子结构与膜磷脂相似，同时具有疏水基和亲水基，正是这种两歧性（amphipathic），使AmB通过真菌细胞壁时能与胞膜发生作用。AmB的作用机制就在于能与真菌细胞膜上的麦角甾醇、磷脂结合形成稳定复合物，在膜上形成微孔，改变膜的通透性，导致细胞内钾离子、氨基酸、核苷酸等重要物质外漏，从而破坏细胞正常代谢，抑制其生长。对两性霉素B耐药推测为细胞中甾醇的量和/或质发生改变引起，细胞膜上主要甾醇成分已不是麦角甾醇，而被其它甾醇所代替和/或细胞膜上总麦角甾醇量减低，这些变化可能与ERG2或ERG3基因突变有关。唑类抗真菌药物能抑制细胞膜上麦角甾醇的生物合成，导致细胞膜中缺乏AmB结合位点，使真菌对AmB产生耐药性。提示，氟康唑与AmB不宜联合应用。

　　3.3对氟胞嘧啶耐药机制[21，22]

　　真菌对5－FC产生耐药性的主要机制是由于降低了药物的吸收（即失去了渗透酶的活性），或是当真菌由于缺少胞嘧啶脱氨酶或尿嘧啶磷酸核糖基转移酶时，使5－FC不能转化为5－氟鸟苷酸（FUMP）。

　　对5－FC固有耐药是较普通的表型，据估计约10％临床分离的白色念珠菌是固有耐药，而约30％菌株可进一步发展为获得性耐药。有学者研究了念珠菌对5－FC耐药的的遗传特性，对5－FC耐药是隐性遗传，决定念珠菌对5－FC耐药的等位基因有3型：第1型为FCY/FCY纯合子，该等位基因决定念珠菌对5－FC敏感；第2型为fcy/fcy纯合子，该等位基因决定念珠菌对5－FC完全耐药；第3型为fcy/FCY杂合子，该等位基因决定念珠菌对5－FC轻度耐药，纯合子（fcy/fcy）耐药表型可由杂合子（FCY/fcy）进一步突变或有丝分裂重组产生。对5－FC固有耐药通常是胞嘧啶脱氨酶缺失的结果。在白色念珠菌中对5－FC获得性耐药主要是由于尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（UPRTase）活性减低引起。含FCY/FCY纯合子菌株具有高UPRTase活性（大约3U），含FCY/fcy杂合子菌株具有低的UPRTase活性（约1.5U），而具有fcy/fcy纯合子的菌株几乎检测不出UPRTase活性。在单倍体新型隐球菌中基因突变最可能引起5－FC耐药。遗传分析表明有两个遗传位点FCY1和FCY2，FCY2和FCY1突变可产生5－FC耐药。

　　总之，真菌耐药机制十分复杂。菌株呈高度耐药可能是多种耐药机制共同作用的结果。Perea等对耐药白色念珠菌的流行病学调查发现：85％的耐药株为外排泵过度表达；65％和35％的耐药株为药物靶酶改变或过度表达；75％的耐药株为多因素联合耐药。

　　4酵母样真菌对抗真菌药物耐药性

　　新的抗真菌药物在免疫力低下病人广泛和长期应用，使得获得性耐药菌株越来越多，在临床上念珠菌对唑类药物的耐药最常见，成为真菌病治疗的一大难题。许多学者对此进行了深入研究和报道。但不同国家和地区耐药状况有所不同，不同菌种对不同的药物耐药率也存在较大差异。

　　美国学者Ostrosky－Zeichner等[24]对分离于血流中的2000株念珠菌进行了抗真菌敏感性调查，结果表明：除克柔念珠菌和热带念珠菌外，大于95％菌株对5－FC敏感，分别有12％和6％克柔念珠菌和热带念珠菌对5－FC耐药；对两性霉素B耐药菌株较罕见，仅2％～3％近平滑念珠菌和克柔念珠菌对其耐药；克柔念珠菌和光滑念珠菌对氟康唑和伊曲康唑存在较高耐药性，两种菌对氟康唑耐药率低于10％，而对伊曲康唑耐药率则达18％。Messer等进行的大型调查研究结果表明1997年至2003年临床分离的念珠菌对唑类抗真菌药物的敏感性变化较小，白色念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌对伏立康唑、ravuconazole、氟康唑等仍具有较高敏感性（≤1.3％耐药），光滑念珠菌对唑类药物耐药率小于20％。值得注意的是拉丁美洲分离的光滑念珠菌对ravuconazole和两性霉素B耐药率分别达到33％和27％，高于南美洲国家的17％和13％。

　　Hajjeh等[9]报道1998～2000年间从康涅狄格和巴尔的摩收集了1443株引起血流感染的念珠菌，其中白色念珠菌对氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶耐药率分别为1.2％、0.9％和4.3％；光滑念珠菌对上述3种药物的耐药率分别为7.1％、19.5％和0；热带念珠菌分别为6％、6％和<1％；克柔念珠菌分别为35％、25％和5％；近平滑念珠菌对氟康唑、伊曲康唑和氟胞嘧啶耐药率较低，分别为0、<1％和<1％。Meis等[10]报道1997年6月至1998年12月间全球抗真菌监测研究组从临床收集了20900个酵母样真菌，其中常见菌株白色念珠菌14368株、光滑念珠菌2073株、热带念珠菌869株、近平滑念珠菌752株、克柔念珠菌351株、新型隐球菌284株，这些菌种对氟康唑的耐药率分别为0.8％、13.2％、3.9％、2.5％、34.8％和5.6％。Pafller等测定了5－氟胞嘧啶对1992年至2001年从世界200多个医学中心收集的8803株念珠菌的体外抗菌活性，5－FC对念珠菌有较好的抗菌活性，MIC90≤1μg/ml，平均只有3％分离菌株对5－FC耐药，但克柔念珠菌耐药率相对较高，达28％。

　　法国Newman等1994年报道Pasteur医院和其他几个研究中心分离自艾滋病患者的念珠菌中有10％对氟康唑耐药。在土尔其从临床肿瘤患者标本分离的56株白色念珠菌中，有12.5％、10.7％和5.3％菌株分别对氟康唑、酮康唑和氟胞嘧啶耐药；14.3％（1/7）近平滑念珠菌对氟康唑耐药。在意大利，Testore等2004年报道从临床标本中分离的1565株念珠菌中，有4.7％菌株对氟康唑耐药。Cuenca－Estrella等[23]报道1996年至1999年从西班牙和阿根廷99个医学中心血流感染标本中分离出744株念珠菌，有97.5％菌株两性霉素B MIC≤1μg/ml；有8.3％菌株对氟胞嘧啶敏感性减低；分别有9.9％和21.9％菌株对氟康唑和伊曲康唑敏感性减低。

　　国内孙长贵等[25]研究了2001年至2003年从临床标本中分离的226株念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、两性霉素B和氟胞嘧啶等四种抗真菌药物体外敏感性，结果表明：226株受试菌对氟胞嘧啶和两性霉素B敏感性最高，16株近平滑念珠菌对四种药物均敏感，最常见的白色念珠菌对氟康唑、伊曲康唑和两性霉素B的耐药率分别为9.5％、7.7％和8.3％，热带念珠菌对氟康唑和伊曲康唑耐药率分别为3.2％和6.5％，而光滑念珠菌对氟康唑和伊曲康唑耐药率分别达18.2％和27.2％。

　　张建平等[26]报道2001年4月至2002年12月间从临床标本中分离的359株酵母样真菌对10种抗真菌药物敏感性研究，结果显示：其总体耐药率（不包括中介菌株）最高的抗真菌药物依次为灰黄霉素90.25％、氟康唑52.65％、伊曲康唑45.13％、咪康唑29.53％、益康唑28.13％。白色念珠菌对氟康唑、伊曲康唑、氟胞嘧啶和两性霉素B等药物耐药率分别为54.96％、50.90％、9.46％和0.00；热带念珠菌、光滑念珠菌及克柔念珠菌对上述四种药物耐药率分别为42.86％、36.74％、4.08％和0.00，44.45％、28.57％、3.17％和4.76％，50.00％、30.00％、20.00％和10.00％。

　　台湾省Yang等[27]报道2002年分离的909株念珠菌对两性霉素B和氟康唑的耐药性，有2.5％菌株对两性霉素B耐药，比1999年的0.5％提高了5倍；而对氟康唑耐药率为1.9％，与1999年（8.4％）相比是下降的。

　　在非白色念珠菌中，Krcmery等[12]报道对氟康唑耐药率：克柔念珠菌75％、光滑念珠菌35％、热带念珠菌和葡萄芽念珠菌是10％～25％；对两性霉素B耐药率：葡萄芽念珠菌和皱折念珠菌为5％～20％、克柔念珠菌为10％～15％、季也蒙念珠菌为5％～10％。

　　念珠菌对唑类药物存在交叉耐药性，可能与CDR基因过度表达和/或ERG11基因点突变等有关。

　　对氟康唑耐药的白色念珠菌中，约10％～20％菌株同时也对伊曲康唑耐药。

　　5结　束　语

酵母样真菌感染率的提高和耐药率的上升，给临床抗感染治疗带来严峻挑战；而真菌耐药机制的复杂性，又增加了对感染控制的难度。临床及微生物学实验室应建立抗真菌药物敏感性试验方法，加强对酵母样真菌耐药性的监测及耐药机制的研究，为临床抗真菌感染治疗方案的的制定提供实验室依据。临床医师应根据实验室提供的药物敏感性试验结果，正确合理选用药物。制药专家应根据目前对真菌耐药机制研究的最新成果及真菌的特点，积极研究开发更多新的产品应用于临床。

作者；孙长贵，曾贤铭，杨燕（解放军第一一七医院检验科南京军区医学检验质控中心，杭州310013）

 

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