耐亚胺培南铜绿假单胞菌CARB-3基因的发现

　铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，Pa）是临床常见的条件致病菌，由于其固有和获得性耐药，使临床治疗成为一大难题。CARB基因编码产生羧苄西林酶，为β-内酰胺酶Bush分类中的2c，在我国CARB基因、流行基因亚型的研究未见报道。我们研究分析了2005年1～12月临床分离的34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌（IMPRPa），发现了我院IMPRPa携带CARB-3基因，现总结报告如下。

 

 

　　1  材料与方法

　　1.1  菌株来源与质控菌株  34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌来自于2005年1～12月我院住院病人的临床分离标本（包括：痰液、尿液、伤口分泌物、脓液、血液等），质控菌株包括：铜绿假单胞菌ATCC27853，大肠埃希菌ATCC25922。

 

　　1.2  菌株鉴定及亚胺培南耐药菌株筛选  试验菌株经BD Phoenix100全自动微生物分析仪鉴定到种，采用该仪器配套药敏试验复合板筛选亚胺培南耐药的Pa。

 

　　1.3  主要仪器设备与试剂  Eppendorf centrifuge 5417R 低温离心机，恒温金属浴（杭州大和），MJ Peltier Thermal Cycler（MJ Research），Bio-RAD电泳仪，Bio-RAD 凝胶成像系统， 琼脂糖（OXOID），100bp DNA Ladder Marker（大连宝森），6×Loading buffer（北京天为时代）。

 

　　1.4  模板DNA提取  采用蛋白酶K消化法。

 

　　1.5  基因扩增  引物序列为：P1：5′-AAA GCA GAT CTT GTG ACC TATTC -3′，P2： 5′-TCA GCG CGA CTG TGA TGT ATA AAC -3′，扩增产物为588bp。热循环参数为：93℃预变性3min，93℃ 60s，55℃ 60s，72℃ 60s，最后一个72℃ 延伸5min，共循环35周期。纯水为阴性对照。耐药基因检测试剂盒由无锡市克隆遗传技术研究所提供。

 

　　1.6  结果判断  取10μl扩增产物与2μl 6×上样缓冲液混匀，点样于1.5%琼脂糖凝胶，在100V电压电泳30min，出现588bp的条带即为CARB基因阳性。用凝胶成像系统观察并照相。

 

　　1.7  序列分析  PCR产物经纯化后送上海生工生物工程公司进行DNA序列分析，测得序列在www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST  中的BLASTn程序进行同源性和基因亚型分析。

 

　　2  结果

 

　　2.1  CARB基因PCR检测结果  34株耐亚胺培南铜绿假单胞菌共检出11株CARB基因阳性株，检出率为32.4%，PCR扩增结果见图1。

 

　　2.2  序列分析结果  任意抽取5株CARB基因阳性的PCR扩增产物进行单向测序，测得序列与GenBank中注册号为DQ309773的CARB-3基因完全同源（Identities=100%）。因此我院流行的CARB基因亚型为CARB-3型。

 

　　图1  部分Pa菌株CARB基因PCR产物电泳图　（略）

 

　　3  讨论

 

　　CARB基因最早于1981年在Pa中发现［1］，近年又从不动杆菌、弧菌属、奇异变形杆菌中检出，已发现CARB1-9型9个亚型［2～4］。我院IMPRPa的CARB基因携带率为32.4%，提示医务工作者应重视和加强Pa的防治和耐药监测。对CARB基因阳性菌株进行DNA序列分析，经同源性比较，结果显示：我院流行的CARB基因亚型为CARB-3型。IMPRPa中CARB基因检出、CARB-3基因亚型发现为国内首次报道。

 

　　铜绿假单胞菌是临床常见的条件致病菌，正常情况下不感染人体任何组织，但当人体免疫力下降或严重创伤或医疗操作后，Pa几乎可以感染人体的任何组织，临床可表现为局部化脓性炎症和全身性感染，常常危及患者生命。碳青霉烯类抗生素（如亚胺培南）因其独特的抗菌优势，被临床广泛用于Pa引起的重症感染，导致临床分离株对亚胺培南耐药性增加。

 

　　Pa对亚胺培南耐药的机制主要有膜孔蛋白缺失、外排泵和产酶等三种机制［5］。我们对IMPRPa的耐药机制的相关研究正在进行中。

　　作者：颜英俊　糜祖煌　刘华　杨洋　张凯　杨明清　黄文方　   中华医学研究杂志

 

　　【参考文献】

　　1  Paul G,Joly G ML,Bergogne BE,et al.Novel carbenicillin-lydrolyzing β-lactamases(CARB-5)from Acinetobacter calcoaceticus var.anitratus.FEMS Microbiol Lett，1989,50(1-2):45.

　　2  Alejandro P,Roberto G M,Hector AS,et al.CARB-9 a carbenicillinase encoded in the VCR region of Vibrio cholerae Non-O1,Non-O139belongs to a family of cassette-encoded β-lactamases.Antimicrob Agents Chemother，2004,48(10):4042.

　　3  Nucleotide sequence of the blaRTG-29CARB-5) gene and phylogeny of a new group of carbenicillinases.Antimicrob Agents Chemother，2000,44(4):1070.

　　4  Bert F,Branger C,Lambert-zechovsky N.Comparative activity of beta-lactam agents (carbapenem excepted)against Pseudomonas aeruginosastrains with CARB or OXA beta-lactamASES.Chemotherapy，2004,50(1):31.

　　5  Okamoto K,Gotoh N,Nishino T.Pseudomonas aeruginosa reveals high intrinsic resistance to penem antibiotics:penem resistance mechanisms and their interplay.Antimicrob Agents Chemother,2001,45(7):1964.

　　作者单位：1 610072 四川成都，四川省医学科学院、四川省人民医院检验科2 214026 江苏无锡，无锡市克隆遗传技术研究所