浅谈实验室细菌菌种的保存

 在微生物学、环境科学、分子生物学、毒理学、酶学、疫苗制备、药品生产等等领域的实验过程中，都需要应用各种细菌，储备标准菌种、参考菌种、特殊菌种是必不可少的，下面就几种实验室菌株的保存方法简述如下。

    1  斜面低温保存法

 

    将分纯的待存菌接种于适宜的固体斜面培养基上，得到充分生长后，用封口膜封口，贴上标签，保存于4℃的冰箱中。此法操作简单、使用方便、不需要特殊设备，是实验室菌种保存最常用的方法。但保存时间短，一般每个月都要移种1次，而且菌种容易变异，所以此方法只适合实验室短期实验菌株的保存。

 

    2  半固体琼脂法

 

    用接种针将以分纯的待存菌，穿刺接种于半固体中，放入培养箱培养后取出，封上无菌的液体石蜡，贴上标签，放4℃冰箱保存。此方法简便易操作，不需特殊设备、技术难度不大，但保存的时间不长，一般只能保存1年以内，而且对抵抗力弱以及一些特殊菌种大概只能存活3～6个月，需要频繁的传代，这样很容易使菌株受到污染、变异。所以此方法不适用菌种的长期保存，只适合实验室一些要求不高的菌种的短期保存。

 

    3  液体石蜡保存法

 

    将液体石蜡灭菌，放于37℃恒温箱中，使水汽蒸发掉备用。再将已分纯的待存菌在最适宜的斜面培养基中培养，使得到健壮的菌体，用无菌吸管吸取已灭菌的液体石蜡，注入已长好的斜面培养基上，用量以高出斜面1cm为准，将试管直立，贴上标签，置4℃下保存。此法制作简单，不需要特殊设备，菌种可以保存1年左右不需要经常移种，缺点是保存的时候需要直立放置。此方法适合实验室短期菌株的保存，而且保存时需要一定的空间［1］。

 

    4  高层半固体琼脂石蜡保存法

 

    将待存菌经平板划线分离后，挑单个菌落用接种针反复穿刺接种到高层半固体琼脂培养基中，经培养箱培养后取出，用灭菌过的液体石蜡滴加到半固体琼脂菌种管表层约0.5cm高度，贴上标签，存放4℃冰箱。此法操作简便，不需要特殊设备，效果好，可以保存菌株1～2年。所以适合实验室菌株的较长期的保存［2］。

 

    5  纸片法

 

    将已分纯的待存菌用无菌镊子镊取纸片，在纸片上刮取4～5个菌落，放入冻存管内，盖上盖子后用封口胶布封住边缘，贴上标签，放入冰箱冷冻保存（－20℃左右）。此方法具有操作简单、不需特殊设备、经济实用、保存空间小等，而且保存时间至少2年，但对一些营养要求比较高的菌种，存活率不理想。所以此方法适合实验室一些营养要求不高的菌种较长时间的保存［3］。

 

    6  甘油液保存法

 

    将已分纯的待存菌接种于肉汤中，37℃培养18～24h，然后按5份肉汤溶液、2份甘油－生理盐水保存液的比例分装于灭菌的微量离心管或细胞冻存管中，贴上标签，置－80℃～－20℃冰箱保存。此法操作简便，不需要特殊设备，效果好，可以保存菌种3年左右，无变异现象，而且此方法还可以保存一些要求较高的特殊菌种，适用范围广。所以此方法适合实验室普通菌种或特殊菌种的较长期的保存［4］。

 

    7  湿牛奶冻存法

 

    将待存菌种于各自生长良好的平板培养基上，经分纯后放入培养箱培养。用准备好的保护剂牛奶洗下菌苔，再用无菌毛细滴管吸取菌悬液滴入菌种管球部，每管球部约有一半的菌液，之后火焰封口，贴上标签，保存于－20℃冰箱。此方法操作比较简便，不需特殊设备、不需要花费很多时间，而且保存时间大约3年，时间较长，不易变性，也不容易污染。所以此方法适合实验室菌种较长时间的保存［3］。

 

    8  蒸馏水保存法

 

    取灭菌蒸馏水6～7ml加于已接待存菌斜面培养基的试管内，用吸管研磨，洗下斜面上的菌苔，充分混匀，将此菌液分装于灭菌的螺旋小瓶中，或用胶塞密封，贴上标签，置于4℃保存。此法制作简单，不需要特殊设备，且不需要经常移种，而且可以保存数年，但要注意保存的时候需要直立放置。所以此方法适合实验室菌种的长期保存［4］。

 

    9  冷冻真空干燥法

 

    将待存菌分纯后，用准备好的保护剂牛奶洗下菌苔，把菌悬液滴入菌种管后，在管口抽取少许棉花塞入管内细颈处，放入冰箱－40℃速冻40min，放入准备好的混有盐的冰中，接上真空泵，真空抽干呈粉末状，火焰封口，贴上标签，保存于－40℃冰箱。此法保存时间长，可达15年，不易变性，但需要专用仪器，一般实验室难以配备，而且过程复杂，操作难度大，需要较长时间才能完成。所以此方法适合具有条件的实验室菌种的长期保存［3］。

 

    10  小结

 

    综上所述，我们在做实验过程中或者短期保存菌种时，可以选择斜面低温保存法、半固体琼脂法、液体石蜡保存法、高层半固体琼脂石蜡保存法、纸片法，进行保存；如果需要较长时间的保存菌株，可以选择甘油液保存法、湿牛奶冻存法、蒸馏水保存法、冷冻真空干燥法保存菌株，其中冷冻真空干燥法需要实验室配备好相应的仪器设备。如果一些菌株营养要求比较高的话，可以选择甘油液保存法、冷冻真空干燥法保存。当然上述菌株保存的方法不是最理想、最方便的保存法，还需要我们不断的探索，不断的研究，找到一种或几种简单、方便、时间长的保存方法。

作者：张晓雷， 董小青， 王丹敏

作者单位：300162 天津，武警医学院微生物教研室

 

【参考文献】

  1 胡海林，郭维植．细菌实验菌种的保存及管理．福建医药杂志，2000，22(1)：113．

2 陈秀英．菌种保存方法的比较．中国卫生检验杂志，2002，12(2)：231.

3 叶迎春，赵世鸿，凌体淑. 3种菌种保存法比较. 中国误诊学杂志， 2004,4(3):386.

4 黄霞云．菌种保存方法的改进．广东医学院学报，1999,17(1)：7.