临床标本的厌氧菌检验

厌氧菌检验是临床微生物检验的重要组成部分。在无氧(或少氧)条件下，或氧化还原电势低的条件下才能繁殖的细菌称为厌氧菌。

 

　　因为厌氧菌在人体肠道、口腔、泌尿生殖道正常菌群中占优势，所以当人体菌群失调时，厌氧菌可能侵犯人体许多部位，发生严重的甚至致死的内源性厌氧菌感染。厌氧菌感染常发生在深部伤口，但也可伴兼性厌氧菌和需氧菌侵犯人体任何器官和组织，根据文献统计深部感染约一半以上有厌氧菌参与。所以，对厌氧菌检验应给予高度重视。

　　一、培养厌氧菌的基本原则

 

　　厌氧菌培养操作方法并不比需氧菌难，只要严格遵守以下基本原则进行操作，即能成功地进行分离［1］。

 

　　1. 正确地选择标本：下列细菌学指征有助于选择标本做厌氧培养：(1) 深部伤口或软组织脓肿的脓，特别是伴有恶臭或含有硫磺颗粒时。(2) 可疑为气性坏疽或少见的严重产气或坏死性感染所取得的坏死组织或病灶清除材料。(3) 粘膜部位的感染灶取得的材料。(4) 从脑、肺、肝或其他器官的脓肿或从腹腔内、肛周、隔下或其他部位的脓肿取得的材料。(5) 无菌区感染灶的吸出液，包括血液、脑脊液、腹水、胸水、滑膜液或羊水等。(6) 人或动物咬伤感染灶取得的材料。(7) 变黑的或置于紫外线发红色荧光的渗出物。(8) 革兰染色镜下，观察到具有厌氧菌独特形态的材料。(9) 可疑引起肉毒杆菌食物中毒的食物。

 

　　2. 正确地收集标本：厌氧菌是人体许多部位(如皮肤、口咽部、肠道和泌尿生殖道)正常菌群中的一部分，因此下列材料无需做厌氧培养：(1) 咽、鼻、尿道、阴道或直肠拭子。(2) 咳出的痰，通过支气管镜取的分泌物，排出或导出的尿、粪便及胃内容物。为排除或尽量减少正常菌群中厌氧菌的污染，用注射器抽取标本比用拭子更好，特别适用于下列临床情况：(1) 从未开放的脓肿抽取脓液。(2) 通过胸腔穿刺抽出的胸腔液。(3) 尿(从耻骨联合上方做膀胱穿刺吸出或从肾造口管收集)。(4) 肺分泌物(气管切开吸取)。(5) 腹腔液(穿刺抽出)。(6) 通过腰椎穿刺抽出脑脊液。(7) 窦道标本可插入小导管，用注射器吸出。也可自窦道损伤部位取材做活组织检查。注射器和针头内的气体应全部排出，将其内容物直接注入一个已排出气的无菌试管内。如果必须使用拭子，应尽快接种于适宜培养基中。将取材的拭子、塑料导管内的小量液体、吸入注射器的标本及时装入厌氧生物袋或管，在运送过程中要保持厌氧状态。培养基内不应含有肝素，因它会抑制细菌生长。

 

　　3. 正确地运送标本：一旦临床标本离开人体部位，进入厌氧环境前，必须防止大气中氧的毒性作用。为此强调使用已排气的不含氧小管收集标本，可自行制备或使用商品容器。后者是由带有凹陷的丁基橡皮塞试管和螺旋盖组成，该管内装有预还原的无营养成分的含有半胱氨酸和刃天青指示剂的培养基，经过无氧CO2冲洗，高压灭菌，手套箱内制备的。将抽取标本经橡皮塞注入管内，送实验室。管内厌氧菌最少存活24～48 h。若不能在2～3 h内接种培养则应保存于15℃。这样即使是对冷敏感的脆弱类杆菌仍可存活。将注射器内标本装入无氧塑料袋也可有效地运送。短时间(20 min内)运送，只用注射器装袋就可以。组织块可装入无氧塑料袋内运送。

 

　　4. 使用新配制的培养基：初代接种厌氧菌最好使用新配制的培养基，它的质量最好。平板培养基无需在厌氧条件下贮存，用前可进行预还原，但厌氧贮存可延长培养基的有效期。如果厌氧贮存时间超过72 h，气袋内不应含有过高浓度CO2。新制备的培养基可装入经反向折迭的塑料袋内，放冰箱内可存至两周。

 

　　5. 提供可靠的厌氧环境：使用厌氧罐法或厌氧箱法。Gaspak厌氧罐［1］适用于100 mm和150 mm的两种平皿，并有一次性使用的发生氢、CO2试剂袋和一次性使用的厌氧指示剂(美蓝或刃天青)，再加催化剂钯粒使之成为既简便又实用的厌氧培养装置。

 

　　在10～15 min内凝结水使罐内或罐的内壁上呈现雾状，同时催化剂反应室部位透过罐盖变得温热时，即达到了无氧。如果在20～40 min内不出现上述现象，可能是催化剂用量不足，或老化，或未充分活化；或厌氧罐盖不严。过夜孵育后，美蓝或刃天青指示剂应出现无色。罐内压力应稍大于罐外大气压，以免气体反流。

 

　　因为氢是一种易燃易爆气体，使用时谨防实验室事故发生。必须熄灭其附近的火焰，厌氧罐不能有裂痕，罐内金属网罩必须完整无缺。

 

　　厌氧箱法：带手套的厌氧箱法是用催化剂和无氧气体保持箱内厌氧环境，并连接交换台，经过此台标本可出入箱体。

 

　　二、 厌氧生长条件的质量控制——化学指示剂和生物指示剂

 

　　在厌氧培养中必须使用氧化还原指示剂一般采用亚甲基美蓝或刃天青。每次要新鲜配制，在试管内将亚甲基美蓝(0.5%亚甲基美蓝3 ml加水至100 ml)、6%葡萄糖和氢氧化钠(1/10 mol/L NaOH 6 ml加水至100 ml)3种溶液等量混合并煮沸还原至无色，立即将指示剂管放入预先装好培养物的罐内，然后加盖密封并按前述方法充气。如果能在孵育的整个过程中维持厌氧条件，则指示剂溶液将无色，否则指示剂则变色。刃天青有氧为紫红色，亚甲基美蓝有氧为蓝色。

 

　　对营养要求高和厌氧条件要求严格的厌氧菌，可使用质控菌溶血芽胞梭菌或b型诺维芽胞梭菌陪同生长，阴性质控菌为绿脓假单胞菌。

 

　　三、 培养物的接种

 

　　多种液体和固体培养基，包括各种选择培养基可用于临床标本的初代接种。但没有哪一种培养基最适于所有厌氧菌生长。补加还原剂和经预还原的培养基，培养效果较好。此外，生长还受培养基成分、贮存时间长短和被检菌特性的影响。由于许多厌氧菌被兼性厌氧特别是奇异变形杆菌过快的蔓延生长所掩盖，所以混合标本中总有少部分厌氧菌不能从非选择培养基上分离出来。大多数类杆菌可在卡那霉素-万古霉素冻溶血琼脂培养基上分离出。非选择培养基和卡那霉素-万古霉素冻溶血琼脂培养基两者结合起来可将厌氧菌检出率提高到94%。孵育的第1天末有19%被检出，第2天末可检出70%。其余的在3～7日间孵育被检出。Livingston等证明用50%乙醇与标本混合作用1 h是选择分离芽胞梭菌的有效方法，用此方法分离芽胞梭菌的效果比加热处理好。标本收集后应尽快接种，操作方法如下。

 

　　1.用拭子(或注射器取材或负压取材)接种下列新制备的固体培养基：(1) 胰酶大豆血琼脂平板(BA)。(2) 含维生素K1(10 μg/ml)和氯化血红素(5 μg/ml) 的布鲁血琼脂平板(BRBA)。(3) 加维生素K和氯化血红素的卡那霉素-万古霉素冻溶血琼脂平板(KVLB)。(4) 类杆菌胆汁七叶苷琼脂平板(BBE)。(5) 苯乙醇血琼脂平板(PEA)(供选用)。

 

　　同时做直接涂片革兰染色检查。用铂铱合金环(不用镍—铬合金的，因为它可氧化接种物)三区划线接种平板，以保证长出单个菌落。

 

　　将拭子直接放入一支或两支强化的硫乙醇酸盐的培养基(THIO)管内，轻轻旋转(避免搅动)。也可选用新煮沸并冷却的疱肉葡萄糖(CMG)培养基。

 

　　2.如果收到的标本是液体的，则用毛细吸管滴加1滴或数滴于各种平板上接种，同时加几滴于强化的THIO培养基管底部，不要振荡。

 

　　3.若被检标本是组织块，则立即将其移入无菌的组织研磨器内，用硫乙醇酸盐混合研碎，最好在厌氧箱内或无氧条件下操作。组织匀浆液的接种方法与液体标本相同。

 

　　4.假如可疑含有芽胞梭菌，还要用乙醇或加热处理标本，然后接种蛋黄琼脂(EYA)平板。

 

　　四、直接涂片检查

 

　　原始标本接种培养基后涂片(如果载玻片已火焰灭菌，也可在接种前涂片)并做革兰染色。通常拭子上的剩余标本是足够用来涂片的。当有足够的标本或收到两个拭子时，最好在接种培养基前做革兰染色，这个涂片检查可提示需要接种哪些常规不使用的选择性的或其他需补加的培养基。涂片检查可看出有无细菌，微生物的类型和大概的数量以及芽胞、形状和位置(芽胞梭菌)、革兰阳性菌分枝的特征(放线菌)，成对或链状排列的革兰阳性球菌(葡萄球菌、链球菌、厌氧球菌)和圆形或尖形末端的革兰阴性杆菌(类杆菌和梭杆菌)。同时，还可看到厌氧菌的多形性和着色不匀性。对血性液体或浓稠分泌物用吖啶橙染色比革兰染色较易观察。这些初步结果应该及时向主管医生报告，以帮助他们正确选用抗菌药物。涂片检查可核对培养结果，是实验室质量控制的一个重要指标。

 

　　五、培养物的孵育：所有接种的培养基均按下述方法35℃孵育

 

　　1. 需氧孵育：BA(血琼脂)平板在烛缸内(约3%CO2)或CO2孵箱需氧培养。接种THIO肉汤、EMB(伊红美蓝)或麦康凯平板需氧培养。过夜孵育后检查结果，然后，用需氧培养方法进行分纯、鉴定，做必要的抗生素敏感性试验。

 

　　2. 厌氧孵育：可选用KVLB、BRBA、BBE和PEA，必要时加鸡蛋酵母平皿(EYA)或含抗血清平板。这些培养物须放在有氢和CO2发生剂及厌氧指示剂的厌氧环境中，平皿下方铺一张吸水纸巾用以吸收在孵育过程中形成的过多的水份。48小时后检查THIO管及固体培养基，如与革兰染色结果一致，则THIO可被弃去，否则THIO需转种到BRBA(或其他合适的培养基)上再次进行厌氧培养。所有的平板初次厌氧孵育最少需48 h(生长慢的微生物可能需达7 d)，若不足48 h将厌氧罐打开，即便再重新厌氧孵育，那些对氧高度敏感的厌氧菌株也会终止生长。

 

　　六、培养物的检查

 

　　经适当孵育后，从Gaspak罐里取出所有平板，1次仅取空1个厌氧罐以蛱减少平皿不必要的暴露，用放大镜检查平板上的细菌生长情况。将观察到的菌落类型描述记录在一张工作单上，然后按以下步骤处理：

 

　　1. 挑取每种不同类型的菌落分别接种：(1) 纯BRBA平板，在厌氧环境；(2) 巧克力琼脂平板，置CO2条件下；(3) BRBA平板，在需氧条件下；(4) THIO培养管中孵育。

 

　　2. 纯血平板上分区划线接种：第一划线区放置卡那霉素(1000 μg/片)、多粘菌素E(10 μg/片)和万古霉素(5 μg/片)。注意：除多粘菌素外，这些纸片含药量与那些用于药敏试验纸片含药量不同，故其结果不意味着在抗生素治疗中细菌对药物的敏感性。为快速鉴定厌氧消化链球菌，可在第二划线区内放一个聚茴香脑磺酸钠(SPS)纸片。为了随后做硝酸盐还原试验，在这个划线区再放一个及一硝酸盐纸片。总共5个纸片放于接种物量最大的区域内。

 

　　厌氧BRBA平板，CO2平板和THIO管孵育48 h，需氧培养孵育18～24 h。当上述次代培养的操作正在进行时，这些接种好的平板可以放入室温下有CO2气流从底部排出的玻璃缸内，一直到将其置于厌氧环境中为止。玻璃缸顶部装有一个1/2寸厚的有机玻璃盖，盖上有一个小孔可排出CO2，使缸底的CO2形成连续的气泡。

 

　　3. 同时要在紫外线下检查初代分离的KVLB平板和BRBA平板上是否存在产黑色Porphyromonas及Prevotella的菌落，其特征是发砖红色荧光。做最后鉴定的生化和其他试验参见中华医学检验杂志1999年增刊［2］。

 

　　4. 过夜和48 h孵育后，分别检查次代培养的需氧平板和CO2平板，如果有菌生长，则很可能不是厌氧菌(少数耐氧厌氧菌可生长)。如果被检菌未曾做需氧培养，则应继续按需氧鉴定程序进行鉴定。

 

　　5. 经48 h孵育后，检查厌氧孵育的次代培养的生长情况及溶血、色素产生、琼脂凹陷和菌落形态等。如果出现厌氧菌的纯培养，则进行革兰染色镜检并记录结果。革兰阳性和阴性厌氧菌的快速鉴别方法：(1)稀释的碱(KOH)破坏革兰阴性菌的细胞壁；(2) 读取鉴定用抗菌药物纸片的结果；使用的3种抗菌药物纸片，其抑菌环直径＜10 mm为耐药；(3) 厌氧消化链球菌对SPS纸片可出现直径12～18 mm抑菌环而绝大多数其他革兰阳性球菌是耐药的。其他厌氧菌如放线菌属和类杆菌属中某些菌对SPS可能敏感，但也可以耐药，因此无助于鉴定；(4) 从平板表面取下硝酸盐纸片放入一平皿内加常规用的A、B两试剂各1滴，结果判定同需氧菌。(5) 动力可从THIO内取4～6 h的培养物用载玻片做成密封的悬滴片进行镜检。

 

　　6. THIO内的纯培养生长物也要做革兰染色镜检，并记录其结果，要特别注意革兰染色反应，菌细胞形态及其排列。

 

　　7. 检查EYA平板上卵磷脂酶和脂酶活性，生长物周围的培基内形成一个混浊的不透明带说明存在卵磷脂酶，菌落表面如有水上浮油般的光泽，则表示有脂酶产生。这个平板还可用来检查触酶，方法是置空气中暴露30 min，然后于菌落上滴加3%过氧化氢观察有无气泡产生。

 

　　8.快速靛基质纸片反应：从纯血琼脂平板上取一满环生长物涂于浸有二甲氨基桂皮醛盐酸溶液的滤纸片上。产生蓝色为阳性反应，无变化或显黄色表示阴性反应。

 

　　9. 测定胆汁的作用：培养基中加入牛胆汁和去氧胆酸盐，观察其抑制还是促进细菌生长。

 

　　10. 耐氧试验及结果判读：接种2套培养物，每套含有两种细菌：1种为被检厌氧培养生长物，另1种为大肠埃希菌。其中1套置于大气环境培养，另1套置于厌氧环境培养。如果厌氧培养生长物在厌氧环境和大气环境中均生长，说明该被检厌氧培养生长物为兼性厌氧菌；如果被检厌氧培养生长物在厌氧环境生长，而在大气环境中未生长，说明该被检厌氧培养生长物为专性厌氧菌。大肠埃希菌应在两种环境下均生长。

 

　　七、厌氧菌的快速处理法

 

　　对某些革兰阴性杆菌和某些芽胞梭菌，可根据革兰染色具有独特形态的病原菌做出合理的预测。荧光抗体可用于脆弱类杆菌和产生黑色素Porphyromonas及Prevotella菌的分组。

 

　　当患者病情危重情况下，通常在48 h之前检查厌氧平板是很重要的，为此可做两套培养分别置两个厌氧罐内，以便在24 h检查其中一套。采用初步分组程序［2］对厌氧菌可作出初步鉴定以指导治疗。

 

　　八、生长物的定量

 

　　正规的生长物定量在临床实验室内不常做。然而，实验室至少应该规定出粗略定量方法，可以按+～++++分级方法(如果只有少数菌落，可简单表示其数目)分别表示极少量生长、少量生长、中度生长或大量生长。这有助于测知分离物的意义和在混合感染中各种细菌的相对重要性。对烧伤脓毒症和预测其创面皮肤移植的可接受程度而言，生长物的定量是重要的。有些人认为培养物的定量可预测外科刀口感染，据此决定在早期还是推迟缝合伤口。

 

　　附：厌氧菌分离鉴定程序。

 

 

 

　　九、厌氧菌的耐药性和药物敏感试验

 

　　由于厌氧菌生长缓慢，药物敏感试验(药敏)要经2～4 d才能得到结果，且甲硝基达唑等药物对大多数厌氧菌有疗效，所以过去厌氧菌感染多采用经验治疗，多数情况下效果满意。但是，近年来，随着抗菌药物的广泛使用，厌氧菌的耐药性也逐年增高。厌氧菌中最常见的脆弱类杆菌已能产生β-内酰胺酶，破坏青霉素和头孢菌素。因此，在有条件的实验室应该开展厌氧菌药物敏感试验，特别是严重的感染，心内膜炎、脑脓肿和骨髓炎等需长期治疗，或经经验治疗而感染仍在继续或复发，都需进行药敏测定。厌氧菌药敏试验是使用与需氧菌类似的稀释法。包括全量和微量肉汤稀释法、琼脂稀释法、浓度梯度等。

 

　　厌氧菌药敏的质量控制：质量控制的目的是全面检查培养基，抗菌药物浓度和操作技术是否合格。美国临床实验室标准化委员会(NCCLS)要求每次药敏试验至少做2个标准菌株并推荐作为厌氧菌药敏试验质量控制的标准菌株和标准菌株对某些抗菌药物预期的MIC值［3］。

作者：苏建荣　马纪平

单位：苏建荣（100050 首都医科大学附属北京友谊医院检验科）；马纪平（100050 首都医科大学附属北京友谊医院 检验科）

 

参考文献

 

　　1　Baily, William Robert Arthur. Diognostic Microbiology. 9th edition, London: The C.V. Mosby Company, 1994.53-59,85-87,247-276.

　　2　马纪平，许淑珍.我国厌氧菌检验现状及改进措施.中华医学检验杂志，1999，22增刊：9-11.

3　National Commitlee for clinical Laboratory Standards. M11-A4. 5th ed. Pennsylvania: NCCLS, 1993.